O *O *OH NHCOCH 3n543216HO 从虾壳中提取甲壳素实验原理1甲壳素性质甲壳素(Chitin)，又称几丁质、壳多糖、甲壳质，是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以-1，4-糖苷键形式连接而成的，即N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖。

甲壳素结构式甲壳素，无论是在酸性或碱性的水溶液中都不会溶解，只溶于浓盐酸、硫酸、浓磷酸、无水甲酸等，但同时会伴随部分主链的降解，此外还可溶于某些复合溶剂如酰胺/LiCl 。

2甲壳素提取方法及原理甲壳素制备一般采用盐酸脱钙(简称H 法)氢氧化钠脱蛋白质，但这两种化学品对甲壳素的分子链都有损坏，而且能耗高，废弃物对环境污染较为严重。

而采用EDTA 代替盐酸制备甲壳素（简称E 法），由于EDTA 所特有的脱钙机理，同等条件下，其脱钙效果较好，所得的甲壳素分子量较高，而且EDTA 可回收利用，减少了环境污染，并不增加成本。

从天然产物虾壳中提取甲壳素，需要将虾壳中的无机盐（主要为碳酸钙）、蛋白质、脂肪及虾壳色素去除。

从虾壳主要成分可以确定提取甲壳素的主要方法，分别进行酸处理脱除无机盐、碱处理脱除蛋白质和脂肪及虾壳的脱色处理，同时确定检测指标为灰分和含氮量，通过灰分的测定可以研究酸在处理无机盐时的效率，含氮量的测定则可以说明碱处理对产品的氮含量影响或者间接地显示碱对脱除蛋白质的影响。

对此我们可以将整个流程表示为以下几个部分。

（1）脱除无机盐由于虾壳中无机盐主要成分为CaCO3，实验室最常用的酸有盐酸、硫酸、硝酸和磷酸。

硫酸与碳酸钙反应生成硫酸钙微溶于水不利于脱除，硝酸虽然可以与碳酸钙反应且不生成沉淀但是其有氧化性对甲壳素有较大影响，磷酸对甲壳素提取影响较之以上两种小，但是相比较盐酸而言还是不如，由此此次实验脱除无机盐采用盐酸作为主要的试剂。

相关反应式如下：↑++=+22232CO O H CaCl HCl CaCO↑++↓=+224423CO O H CaSO SO H CaCO ↑++=+224433CO O H CaHPO PO H CaCO↑++=+222333)(2CO O H NO Ca HNO CaCO在实验中发现，用酸来处理影响其脱除效率的几个因素分别为盐酸浓度、用量、温度和时间，所以在实验设计时可以按此来安排实验。

（2）脱除脂肪与蛋白质虾壳中富含蛋白质与脂肪，作为动物饲料时是相当的好，但是对于提取甲壳素来说只能作为一种副产物来利用，反应时由于甲壳素不溶于稀碱，而脂肪和蛋白质却可以在稀碱中分解，所以通过碱的处理就可以将甲壳素与蛋白质和脂肪分离。

其中蛋白质与碱反应生成氨基酸盐，脂肪与碱反应生成甘油和可溶性盐（皂化反应），这些产物均可溶于水因此与甲壳素可以较为方便的分离。

（3）脱色漂白为了使产品色泽符合要求还需要进行脱色漂白，实验室中常用高锰酸钾来作为氧化剂，使色素氧化生成二氧化碳脱除其颜色。

由于高锰酸钾的高氧化性可能会导致甲壳素的分子量下降，因此在加入高锰酸钾反应时，需注意反应时间不要太长，以免影响甲壳素的品质。

在氧化完成后需要添加还原剂来还原多余的高锰酸钾，还原剂可以选择草酸或者亚硫酸氢钠。

（4）灰分的检测利用甲壳素在高温灼烧后，完全灰化所剩余的无机物质量作为产品中灰分测定计算基准，灰分测定的计算需要按照实际情况来确定[31]。

计算式为式中，m1——坩埚与灰总质量，g ；m2——坩埚质量，g ；m3——坩埚与产品总质量，g 。

（5）含氮量的检测蛋白质是含氮的有机化合物与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫%10023211⨯--=m m m m X酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。

有机物中的胺根在强热和CuSO 4做催化剂，浓H 2SO 4作用下，硝化生成（NH 4）2SO 4反应式为：424422)(2)(2SO NH H SO H NH =++-+在凯氏定氮仪中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中。

反应式为：4223424222)(SO Na O H NH NaOH SO NH ++=+ O H O B NH BO H NH 274243335)(42+=+用已知浓度的H2SO4（或HCl ）标准溶液滴定，根据HCl 消耗的量计算氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

反应式为：3342424274244)(5)(BO H SO NH O H SO H O B NH +=++ 334274244252)(BO H Cl NH O H HCl O B NH +=++计算式：)1001.0/()014.0)(21⨯⨯⨯⨯•-=F m N V V X 式中，X ——样品中蛋白质的百分含量，g ；V 1——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml ；V 2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml ；N ——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；M ——样品的质量（体积），g （ml ）；F ——氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质中的氮含量一般为15-17.6 %，按16 %计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

实验步骤由于课题是从天然产物中提取甲壳素的工艺研究，而这些原料来源最容易的得到和量最大的就是虾壳，因此本次设计是以虾壳为原料来提取甲壳素。

在一些相关文献中可以看到提取甲壳素的主要步骤分为三大步，分别为虾壳的脱除无机盐、蛋白质的去除以及产品的脱色处理，而衡量这些过程影响的主要指标有灰分测定、含氮量测定及收率。

在进行实验的开始首先要对虾壳处理，主要进行干燥剔除杂质（渔网碎片、小石块等）。

本次试验若没有特殊说明每次取虾壳均为5 g。

（1）酸处理去除无机盐称取经干燥后的虾壳并放置于100 ml的烧杯中，打开恒温水浴锅将温度调节到预先设计的大小，用量筒量取盐酸并将之加入到装有虾壳的烧杯中，用玻璃棒不停地搅拌不要让其在加入盐酸的时产生的泡沫将虾壳排除烧杯，与此同时记下时间在规定的浸泡时间结束后取出烧杯并通过抽滤将之分离取固体产物在取固体产物后将之放入到干燥箱中干燥直至恒重为止。

取5 ml的坩埚若干，浸泡于5 %的盐酸中4-5 h取出洗净干燥后重复2-3次烘干至恒重并称取其质量。

（2）碱处理脱除蛋白质与脂肪取虾壳置于100 ml烧杯中，加盐酸40 ml后置于30 ℃的恒温水浴中浸泡2 h，期间需要搅拌防止泡沫溢出，反应结束后取出产品，抽滤并洗涤至中性，将所得固体放入洗净的烧杯中向其中加入相应浓度的氢氧化钠溶液，将水浴锅温度调节至所需温度待温度稳定后把加碱的烧杯放入并计时，待反应至所需时间后取出烧杯。

打开抽滤机，取干净漏斗及滤布，将反应后的产品倒入漏斗中抽滤，期间不断地加入蒸馏水洗涤，待产品pH完全呈现中性时加入无水乙醇洗涤2-3次取出。

（3）产品脱色处理取干净烧杯向其中加入10 ml 0.5 %的高锰酸钾溶液，然后将产品加入反应1-2 h，待反应完全时，向其中加入20 ml的5 %的草酸溶液，待产品完全褪色后，再次过滤洗涤完全，加无水乙醇洗涤2-3次，将过滤后产品放入干燥箱中干燥至恒重后称量。

在此步骤时注意虾壳腔体中的高锰酸钾是否还原完全。

指标检测（4）灰分测定称取干燥后的经过盐酸处理的虾壳，将之加入到坩埚中，将马弗炉温度调制600 ℃左右后，将装有虾壳的坩埚放入到其中灼烧2-3 h，待时间完成后取出称重后再次放入炉中灼烧取出后称重待产品恒重后取出否则继续灼烧。

记录下各部分最终质量，并进行计算。

（5）含氮量的测定样品处理：精密称取0.2-2.0 g固体样品，移入干燥的250 ml定氮瓶（或者单口烧瓶）中，加入0.2 g硫酸铜，6 g硫酸钾及10 ml浓硫酸，稍摇匀后置于电加热套中，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5 h。

取下放冷加20 ml蒸馏水，放冷后移入100 ml容量瓶中，用少量水洗定氮瓶，将洗液并入容量瓶中，再加蒸馏水至刻度，混匀备用。

测量含氮量：按图2.1安装好仪器，于水蒸气发生器2内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒碎砖块以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

向接收瓶内加入10 ml、2 %硼酸溶液及甲基红指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.00 ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10 ml 蒸馏水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。

将10 ml、40 %氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小凯氏定氮装置图图中装置名称：1.热源 2.烧瓶 3.玻璃管 4.橡皮管5.玻璃杯 6.棒状玻塞 7.反应室8.反应室外壳 9.夹子 10.反应室中插管 11.冷凝管 12.锥形瓶13.石棉网玻璃杯以防漏气。

夹紧螺旋夹，开始蒸馏，让水蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5 min。

移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1 min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。

取下接收瓶，以0.025 mol/l硫酸或0.05 mol/l盐酸标准溶液定至紫红色为终点。

注意事项（1）在酸处理时，酸浓度不要超过20%，超过20%时会破坏甲壳素分子内氢键，使其分解。

同样在碱处理时碱浓度不得超过40%，超过会使甲壳素脱乙酰成为壳聚糖。

（2）灰分检测时，应保持马弗炉温度在一定温度范围内，同一批次样品处理需要相同的温度及灼烧时间。

（3）含氮量测定时，在加入碱液时尽量缓慢的提起玻璃塞，否则会使吸收液到如反应始中。

（4）在消化液制取时，一定要在通风橱中进行，消化应注意液体颜色变化。