表格1：推荐不同规格培养板下转染试剂的用量(引用自Qiagen公司技术手册)
9号孔里面细胞的克隆数）设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（ul）。
2、定量PCR法
Day1：在六孔板中按照5×104个/孔接种293FT细胞。
在加入病毒液之前，取两个孔的细胞进行计数，以确定感染时细胞的实际数目，记为N。
Day2：吸去剩余四个孔中的培养基，将病毒浓缩液用培养基稀释200倍，也就是取1ul 病毒加入到199ul的培养基中。
留下一孔不加入病毒稀释液作为对照，另外三个孔中分别加入0.5ul，5ul和50ul的稀释病毒，四孔均补充2ml新的培养基。
感染24h。
更换1ml/孔新的培基，并在培基中添加DnaseI以去除残余的质粒DNA，37℃消化15min；最后加入2ml 293FT 专用培养基，继续培养48h。
Day3：抽提DNA，定量后妥善保存或者马上开展后续实验。
条件（不同公司的要求不一样在此不做统一的标准化介绍）。
数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。
滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V。
（C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为1×105）D = 病毒载体的稀释倍数；V = 加入的稀释病毒的体积数）。
（以上的病毒滴度定量方法，主要是针对收取的病毒原液经过浓缩以后进行定量。
）ShRNA的设计，以李洋设计的shCD133human序列为例讲述
Human shCD133 Lentiviral 从序列设计到病毒包装成形
1．cDNA sequence（设计原理见附件资料）
773-792: GACCCAACATCATCCCTGT
5’-3’ GATCT GACCCAACATCATCCCTGT TTCAAGAGA ACAGGGATGATGTTGGGTC TTTTTA
5’-3’ AGCTTAAAAA GACCCAACATCATCCCTGT TCTCTTGAA ACAGGGATGATGTTGGGTC A
订单发INVITROGEN公司合成，详见：Invitrogen Custom Primers certificate of analysis Fa 5支
Rb 5支
然后用无酶水配成50uM/L每支一共150ul/FA 155ul/RB
各取100ul 做成mixture: Day1 95℃5min
↓
70℃10min
↓
Room temper water bath overnight
↓
Day2 Vortex gently
↓
Stored at -20℃or placed on ice for current use.
2. Human shCD133操作程序
Day 1
psuper载体酶切，切出带有与shCD133 cDNA序列相配的酶切接头Psuper 10 ul
Bgl II 2 ul
Hind III 2 ul
Buffer k 5 ul
ddH2O 31 ul
37℃酶切过夜50 ul reagent
（一次多做几管）
Day 2
1．
Psuper 酶切产物鉴定回收（qiagen回收试剂盒）
2．
回收后点样确定片段大小（约3170bp）
3．
与合成的shCD133 mix 连接反应
DNA T4 ligase 1 ul
Ligase buffer 2.5 ul
退火后的寡核苷酸mix 10pmol 0.4 ul
Psuper酶切产物0.5pmol 10 ul(15.3ng/ul,具体定量要根据质粒浓度确定) ddH2O 11.1 ul (25ul reagent, 16℃连接过夜)
Day 3
连接产物转化stbk3感受态，铺板
Day 4
挑取3-4克隆，摇菌（3ml左右）
Day 5
抽质粒，酶切鉴定
酶切体系：
1．酶切pSUPER-shCD133质粒
shRNA 41 ul (约6 ug)
ECor1 2 ul
Cla1 2 ul
37℃酶切过夜50 ul体系
buffer H 5 ul
Marker 1 2 3 4 5 6 M
DNA2000
1.2号质粒酶切片段处于Marker DNA2000 的250bp上方，273是正确的片段大小.注意3-6道的错误片段，其实与正确的273bp差别不大，要注意仔细区分参比marker250这条带对应的位置。
2．同时酶切pLVTH 载体，用同样的ECOR1 CLA1酶切，切出有能连接pSUPER-CD133质粒的连接端口
pLVTH 10 ul
ECor1 2 ul
Cla1 2 ul
buffer H 5 ul
H2O 31 ul
37℃酶切过夜50 ul体系
Day 6
用1.5的胶全部点样上去，鉴定质粒酶切产物是否正确（shCD133约275bp;
pLVTH11085bp左右），将两种酶切产物鉴定后，进行胶回收（qiagen胶回收试剂盒）shRNA酶切产物
0.3 pmol (1bp的摩尔质量333；273*333=90909 我的回收有45 ng/ul,最后算得加1ul)
pLVTH酶切产物0.003 pmol (11085*333=3691305 我的回收有45 ng/ul,最后算得加11.1ul)
Ligase 1 ul
Ligase buffer 2.5 ul98
H2O up to 25 ul reagent
16℃连接过夜25 ul体系
Day 7
连接产物转化stbk3感受态，铺板
Day 8
挑取3-4克隆，摇菌（3ml左右）,记得保留相对应编号的菌种，待酶切验证后，保留正确的单克隆扩增的菌种。
Day 9
抽质粒，酶切鉴定有上述273bp左右条带，PCR扩增产物，送测序，如果正确，就可以大量抽提。
Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 M
Marker 164-1 164-2 164-3 164-4 M 9 10 M
DNA 2000
从验证图来看，单克隆1、4、6、9号是正确的片段大小，保留其相应的菌种和质粒，质粒用于PCR扩增后送检测序。
（164-1.2.3.4是其他的质粒，序列不在此考虑对错），接下来对1、4、6、9号质粒（还有19 ul）进行定量，然后PCR扩增测序。
测序结果经过比对之后，正确，至此shCD133-Human PLVTH构建成功，可投入病毒的包装。
病毒制备成功之后，感染细胞必须经过Western Blot和RealtimePCR的验证，一般设计sh序列尽量参考有价值的文献进行，如果没有文献可参考，多设计几条，进行封闭效果的摸索和比对。
这是必经的过程，工作量大，但不要怕困难，不要推三推四。
总结
慢病毒实验技术是实用性、稳定性比较高的技术，并且应用前景广泛。
掌握并能熟练应用慢病毒技术，能有助于博士研究生拥有一技之长，对于李桂源实验室也有相应的贡献价值。
而慢病毒实验技术的核心技术在于对穿梭质粒的改造。
细胞的培养，病毒的包装都只属于技巧性的部分。
最后，祝各位兄弟姐妹，尊敬的老师们实验顺利，学业顺利，工作顺利，文章顺利，基金顺利。