开题报告
实验三
在TNF-α刺激前、后分别加入TNF-RⅡ拮抗剂
(Etanercept)、TNF-α单克隆抗体 (Infilixmab),观察FLS的增殖情况,以免 疫组化观察FLS形态变化,以流式细胞仪测定FLS表 面TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2水 平,以Westing-blot测定TNF-RⅡ、NF-κB、 Fas/FasL-Bcl-2、TRAF2及c-IAP1蛋白水平,
2.目前普遍认为FLS表面的 TNF-RⅡ在FLS增殖 中起促进作用。然而,TNF-RⅡ是单独起作用, 还是与其它因素或其它表面受体(如TNF-RⅠ、 mTNF-α)共同起作用?抑或相互制约因素失 衡?分别以抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α的 单克隆抗体封闭FLS表面的TNF-RⅠ、TNF-RⅡ 及mTNF-α,再以TNF-α刺激封闭后的FLS, 观察FLS增殖情况。这一实验将为进一步探明 FLS的增殖机制提供理论依据。
获 取 正 常 人 及 RA 患 者 FLS 体 外 培 养 1ng/ml 2.5ng/ml 5ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 40ng/ml
6h培 养
12 h 培 养
24h培 养
48 h 培 养
免疫组化观察不同浓度、不同时间点FLS形态 流式细胞仪观察FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2的密度 检测TNF-RⅡ、NF-κ B、及Fas/FasL-Bcl-2的蛋白水平 TNF-RⅡ、NF-κ B、及Fas/FasL-Bcl-2 的mRNA变化
实验一 取处于对数生长期的FLS,将TNF-α分成:
1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml
及40ng/ml 6个浓度梯度,在每一浓度梯度的不同时间
点上(6h、12h、24h及48h),以免疫组化观察FLS
形态;在每一浓度梯度的不同时间点上,以流式细胞仪
检测技术来观察FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2 的密度变化;以Westing-blot(免疫印迹)来检测 TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的浓度变化; 以RT-PCR来测定TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasLBcl-2 的mRNA变化。
细胞仪、免疫组化)、蛋白(Westing-blot)
及mRNA(RT-PCR)变化。
(3)在TNF-α刺激前、后同时加入TNF-RⅡ拮抗 剂(Etanercept)、TNF-α单克隆抗体 (Infilixmab),观察体外培养的RA患者FLS 的增殖情况,TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasLBcl-2的表达变化,包括形态(流式细胞仪、免 疫组化)、蛋白
TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的蛋
白水平;以RT-PCR来测定TNF-RⅡ、NF-κB、 及Fas/FasL-Bcl-2 的mRNA变化。
实验二
分别以 抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α的单克 隆抗体封闭FLS表面的TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及 mTNF-α,再以TNF-α刺激封闭后的FLS,观 察FLS增殖情况及观察TNF-RⅡ、NF-κB、及 Fas/FasL-Bcl-2的变化,包括形态(免疫组化、 流式细胞仪)、蛋白(Western-blotting)及 mRNA(RT-PCR)变化;测定下游信号因子 TRAF2和c-IAP1的mRNA变化。
3. 在TNF-α刺激前、后分别加入TNF-RⅡ拮 抗剂(Etanercept)、TNF-α单克隆抗体 (Infilixmab)及同时加入Etanercept和 Infilixmab,观察体外培养的RA患者FLS的增 殖情况,TNF-RⅡ、NF-κB、及Fas/FasLBcl-2的表达变化,包括形态、蛋白 (Westing-blot)及 mRNA(RT-PCR)变 化。 探讨Etanercept和Infilixmab分别应用及合 并应用时对FLS的抑制作用。
TNF-RⅡ、NF-κ B、Fas/FasL-Bcl-2、 TRAF2 及c-IAP1mRNA水平
可行性分析
1.本研究所用研究方法包括免疫组化、流式 细胞仪、Westing-blot、 RT-PCR等,均 为分子生物学常用方法和基本手段。 2.本科室先期的研究发现,在不同浓度TNFα的刺激下,体外培养的RA患者FLS的增殖 是不同的。在给予10ng/mlTNF-α刺激下, 在6h、12h、 24h、48h 时间点上测得的 TNF-RⅡmRNA是不同的,在24h达高峰, 表现出时间依赖性。这为进一步深入研究 提供前期试验基础。
实验一
(1)取处于对数生长期的FLS,调整细胞 浓度, TNF-α按 1ng/ml、 2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、
20ng/ml及40ng/ml 6个浓度梯度,
接种于6孔细胞培养板,分别培养6h、 12h、24h及48h。
(2)在每一浓度梯度的不同时间点上,以免疫组 化(HE染色)观察FLS形态;以流式细胞仪观 察FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2的密度 变化;以Westing-blot(免疫印迹)来检测
RA生物治疗 Infilixmab Etanercept
FLS增殖 NF-κB Fas/FasL Bcl-2
研究目标
1.
在不同浓度TNF-α的刺激下,在不同 培养时间点上,观察体外培养的RA 患者FLS的增殖情况及观察TNF-RⅡ、 NF-κB、及Fas/FasL-Bcl-2的变化, 包括形态、蛋白(Westernblotting)及mRNA(RT-PCR)变 化。 从而明确在什么浓度、在什么时间 点上FLS增殖最显著、TNF-RⅡ表达 最高。
研究内容
滑膜细胞培养 在无菌条件下,取得新鲜的正常人(取外伤 后关节修复或关节内游离体经关节镜切除) 和RA患者滑膜组织(经关节镜切除),以 胶原酶和胰蛋白酶联合消化人关节滑膜组 织碎片,细胞悬液经200目筛网滤过,与 CD14 microbeads混合孵育后 通 过 磁 性MACS分离柱收集抗CD68、CD14抗 体阴性、抗Vimentin、Fibronectin阳性 的非粘附细胞(B型细胞)进行培养。 实 验用3~7代细胞。
已 鉴 定 的 3-7 代 FLS 加 入 单 抗 封 闭 TNFRⅠ mAb TNFRⅡ mAb TNF-α mAb
TNF-RⅠ、 TNFⅡ RⅠ 、 mAb TNF-α
mAb
TNF-RⅡ TNFαmAb
TNF-RⅠ、 Ⅱ 及 TNFαmAb
免疫组化观察不同单抗封闭、培养后的FLS形态
FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2的水平 TNF-RⅡ、NF-κ B、Fas/FasL-Bcl-2、 TRAF2和 c-IAP1蛋白水平的浓度变化 TNF-RⅡ、NF-κ B、、Fas/FasL-Bcl-2 TRAF2和 c-IAP1的mRNA水平的mRNA变化。
TNF-α刺激前FLS 加入拮抗剂培养
TNF-α刺激后FLS 加入拮抗剂培养
Etanercept
Infilixmab
Etanercept & Infilixmab
免疫组化观察FLS形态 观察FLS表面TNF-RⅡ及Fas/FasL-Bcl-2水平
TNF-RⅡ、NF-κ B、Fas/FasL-Bcl-2 、TRAF2及c-IAP1 蛋白水平
开题报告
肿瘤坏死因子Ⅱ型受体在类风湿关节炎成 纤维样滑膜细胞增殖机制中作用的研究 风湿免疫科 张洪峰
立题依据
类风湿关节炎(RA):滑膜炎
关节破坏 滑膜过度和恶性增生 成纤维样滑膜细胞(FLS)
TNF-α
TNF-R
TNF-RⅠ mTNF-α TNF-RⅡ cross talking TRAF2,c-IAP1
Fas/FasL-Bcl-2的表达变化,包括形态(免疫
组化、流式细胞仪)、蛋白(Westing-blot) 及mRNA(RT-PCR)变化。
(2)在TNF-α刺激后分别加入TNF-RⅡ拮抗剂
(Etanercept)、TNF-α单克隆抗体 (Infilixmab),观察体外培养的RA患者FLS 的增殖情况,TNF-RⅡ、NF-κB、及 Fas/FasL-Bcl-2的表达变化,包括形态(流式
以RT-PCR测定TNF-RⅡ、NF-κB、Fas/FasLBcl-2、TRAF2及c-IAP1mRNA水平。
在TNF-α刺激前、后分别同时加入TNF-RⅡ拮 抗剂(Etanercept)、TNF-α单克隆抗体 (Infilixmab),观察增殖情况,观察FLS的增 殖情况,以免疫组化观察FLS形态变化,以流式 细胞仪测定FLS表面TNF-RⅡ、NF-κB、及 Fas/FasL-Bcl-2水平,以Westing-blot测定 TNF-RⅡ、NF-κB、Fas/FasL-Bcl-2、TRAF2 及c-IAP1蛋白水平,以RT-PCR测定TNF-RⅡ、 NF-κB、Fas/FasL-Bcl-2、TRAF2及cIAP1mRNA水平。
2.分别以 TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α的单 克隆抗体封闭FLS表面的TNF-RⅠ、TNFRⅡ及mTNF-α(膜结合型TNF-α),再以 TNF-α刺激封闭后的FLS,观察FLS增殖情 况及观察TNF-RⅡ、NF-κB、及 Fas/FasL-Bcl-2的变化,包括形态、蛋白 (Western-blotting)及mRNA(RTPCR)变化;测定下游信号因子TRAF2和 c-IAP1的变化。 探讨在TNF-α促FLS增殖作用中, TNFRⅠ、TNF-RⅡ及mTNF-α分别起什么作用。
分组方案
A, 抗TNF-RⅠ
B, 抗TNF-RⅡ C, 抗TNF-α D,抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ E, 抗TNF-RⅠ、TNF-α
F, 抗TNF-RⅡ、TNF-α
G, 抗TNF-RⅠ、TNF-RⅡ及TNF-α
实验三
(1)在TNF-α刺激前分别加入TNF-RⅡ拮抗