当前位置:文档之家› 线粒体遗传、蛋白质组学方法、蛋白质相互作用

线粒体遗传、蛋白质组学方法、蛋白质相互作用

线粒体遗传性
线粒体复制后,细胞分裂后线粒体不均等分布。

不均等分离,随机分配
遗传瓶颈genetic bottleneck卵细胞mtRNA从100,000到10~100不等。

mtRNA阈值效应:引起特定组织器官功能障碍的突变mtDNA最少数目
mtRNA阈值的影响因素:1、mtDNA突变类型;2、组织器官的功能状态;3、组织器官的能量依赖程度;4、发育阶段。

mtRNA的遗传特征:1、mtRNA复制具半自主性2、mtRNA遗传密码和通用密码不完全相同3、mtRNA为母系遗传4、复制分离5、mtRNA杂质行与阈值效应6、mtRNA突变率极高。

蛋白质组
信号蛋白、膜蛋白、血清蛋白、受体、酶、遗传
一、蛋白质功能调节:变构效应、磷酸化去磷酸化(与生长、分化、成活、凋亡有关)、蛋白质的酶切激活
基因功能研究方法:蛋白质的鉴定、研究蛋白质相互作用方法、动物水平研究蛋白质功能蛋白印迹法注意事项:蛋白质常温容易失活、一抗二抗浓度是关键、封闭做得不好容易出现非特异杂交
SDS-PAGE电泳--转膜--封闭--一抗--洗涤--酶标二抗反应--洗涤--显色或化学发光显影
蛋白质在酸性条件下是氨基电离,碱性条件下是羧基
2DE(差异凝胶电泳)
双向电泳:第一向进行等电聚焦,蛋白质沿PH梯度分离至各自的等电点;第二向再沿垂直的方向进行SDS-PAGE胶的电泳,按分子量进行分离。

染色:银染、考马斯亮蓝
二、质谱:差异性蛋白的检测、鉴定不同的蛋白质。

准确、微量
1、串连质谱:1、分离、消化肽段;
2、应用高能气体原子撞击成更小的片断;
3、推测小肽段的氨基酸序列。

基质辅助激光飞行时间质谱术、蛋白质指纹图谱技术
2、飞行时间质谱术:肽段与有机酸混合,然后在金属或陶瓷片上干燥。

再用激光使其电离子成离子化气体。

这些初始能量相同的带电离子被加速飞行经过一米的零电场导管到达粒子侦测器。

由于飞行距离L是已知的定数,精确记录离子的飞行时间t,即可得到离子的速度v=L/t.动能E=(1/2)mv^2,可得到离子的质量。

测得的离子飞行时间即可得到原子或分子的质量。

3、免疫共沉淀法(IP)当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的的相互作用的现象被保留下来。

应用特异性抗体将目标蛋白和与其作用的蛋白质共沉淀下来。

收获培养的细胞--裂解细胞--收集上清--加入适量抗体--加入proteinG-Sepharose--离心弃上清--收集沉淀--SDS-PAGE胶。

4、双杂交系统
1)已知蛋白之间相互作用的检测;2)蛋白质的功能域研究:通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变,再用此系统检测是否还存在相互作用,可阐明其功能域或关键氨基酸;3)克隆新基因和新蛋白。

5、噬菌体展示:一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术。

以改构的噬菌体为载体,氢待研究的蛋白质基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区。

感染大肠杆菌后,产生大量噬菌体病毒颗粒。

进而通过亲各富集法收集有特异肽或蛋白质的噬菌体。

主要用途:大规模筛选与目标蛋白相互作用的大量蛋白质或肽段。

三、研究蛋白质相互作用的方法
1、亲各层析
2、免疫共沉淀法(IP)
3、双杂交系统
4、噬菌体展示
四、转基因动物
核转移、干细胞途径。

相关主题