土壤酶的测定
1．三角瓶用稀HNO
3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。
2．土样研磨精细后分袋装好。
土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5×2=29g。
一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）
1．试剂配制：
(1)0.3%过氧化氢溶液：
①（1：100 30%的H
2O
2和水）
②（0.5molH
2O
2+49.5ml蒸馏水）
③（1ml30% H
2O
2+99ml蒸馏水）
(2)3N硫酸：
（10ml硫酸+50ml水）
(3)0.1N高锰酸钾溶液：
（1.58gKMnO
4+100ml蒸馏水）
2．操作步骤：
2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H
2O
2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色
3．结果计算
过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO
4的毫升数表示：
M=（A－B）×T
式中：
A：
空白消耗的0.1N KMnO
4毫升数
B：
滤液消耗的0.1 N KMnO
4毫升数
T：
KMnO
4滴定度的校正值
以容量法测H2O2的酶活：
Kappen
（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H
2O
2与土壤相互作用时，未分解的H
2O
2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H
2O
2）测定H
2O
2的酶活
2 KMnO
4＋5H
2O
2＋3H
2SO
4→2MnSO
4＋K
2SO
2O＋5O2土壤H
2O
2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用
二、蔗糖酶（P278）滴定法
1.试剂配制：
(1)20％蔗糖：
（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）
(2)甲苯(分析纯)
(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液
0.5ml磷酸氢二钠·12 H
2磷酸二氢钾（）
磷酸氢二钠·12H
2：23.88g Na
2HPO
4,，加H
2O溶解，定容至100ml。
磷酸二氢钾（）：9.072g KH
2PO
4，加H
2O溶解，定容至1000ml。
(4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光
(5) H
2SO
4（1：3）（体积比）：15ml 98%H
2SO
4+ 45ml蒸馏水
(6)淀粉指示剂
取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。
（2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。
）
(7)0.1NNaS
2O
3滴定液
取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。
(8)菲林溶液
取3.464克CuSO
4·5H
2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a）,取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水，并稀释至50ml（b），使用前将（a）（b）按1：1混合。
2.操作步骤
取2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。
加2.5ml20％蔗糖和
2.5mlPH5.5醋酸铅－磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。
培养结束后，加12.5ml蒸馏水。
摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H
2SO
4（1：3）。
加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1NNaS
2O
3滴定。
颜色：
棕色→棕蓝色→乳白色（滴定结束）
注意：
减量滴定，一般取5ml即可，滴定需NaS
2O
3溶液（大量）
空白对照：30.15ml（取5ml时）
3．结果计算：
蔗糖酶活性（M），用对照与试验的0.1NNaS
2O
3滴定量毫升数之差表示。
试验应设以水20毫升代替基质。
M=（A－B）×T×
式中：
A：
对照所消耗的0.1NNaS
2O
3毫升数
B：
滤液所消耗的0.1NNaS
2O
3毫升数
T：
NaS
2O
3滴定度的校正值
×：
换算成1g土消耗的0.1NNaS
2O
3量
三、脲酶
1.试剂配制
(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液
取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将PH调至6.7，并将水稀释至20ml。
(2)苯酚钠溶液
称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中。
称27gNaOH溶于100ml水中（B液），存于冰箱中。
使用前，取A,B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。
(3)次氯酸钠溶液
用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
（17.3mlNaClO定容至100ml）。
(4)10%尿素液
10g尿素＋90ml水
50g尿素＋450ml水
(5)甲苯
(6)氮的标准溶液（不要配）
精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。
绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。
2.操作步骤
取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。
15min加10ml 10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中，然后加蒸馏水20ml，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。
20min后显色，定容50ml：1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。
然后按绘制标准曲线（显色方法）进行比色测定。
3．结果计算：
脲酶活性（M）以24h后1g土壤中NH 3－N的毫克数表示
M=x×
标准曲线：
y=0.0268x+0.001804
即：
M=（0.001804-y）×
式中：
x：
从标准曲线查得的NH
3－N毫克数
y：578nm处吸光度
×：
换算成1g土的系数
四、磷酸酶
1.试剂配制
(1)PH=9.8氯化铵－氢氧化钠缓冲液
取20g NaOH溶于100mlNH
4OH中
(2)8%铁氰化钾液
称8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中稀释至100ml（仅在同一周内存放）
(3) 2% 4－氨基安替比林液
取1g 4－氨基安替比林溶于水中，稀释至50ml（仅在同一周内存放）
(4)0.5%磷酸苯二钠溶液
取1g溶于200ml水中
(5)酚的标准溶液（不要配）
酚原溶液的配制及酚工作液的稀释浓度同磷酸苯二钠法
酚原液：
取1g重蒸酚溶于水中，稀释至1L存于棕色瓶中
酚工作液：
取10ml酚原液稀释至1L（0.01mg/ml酚）
(6)甲苯
标准曲线绘制
吸取1,3,5,7,9,11,13ml酚工作液，分置50ml的容量瓶中，分别加20ml蒸馏水，再加0.25ml缓冲液，0.5ml4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。
最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。
根据光密度值于溶液浓度绘制标准曲线。
50－（20＋2＋0.5＋0.5＋0.25）=26.75ml蒸馏水
2.操作步骤
取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加5滴甲苯。
20ml0.5%磷酸苯二钠，充分振荡后在37℃恒温箱中培养2h。
取培养后滤液5ml，分置50ml的锥形瓶中，加20ml蒸馏水，再加0.25ml 缓冲液，0.5ml4－氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾液，每次充分摇动。
最后定容至50ml，15min内在分光光度计上于波长510nm处比色。
3．计算
磷酸酶的活性（M），以2h后100g土壤中P
2O
5的毫克数表示
M＝x×80×0.32×2.29
标准曲线：
y=0.002161x-0.000839
即：
M=（y+0.000839）×80×0.32×
式中：
x：
从标准曲线查得5ml滤液中酚的完整数
y：510nm处吸光度
80：换算为100g土壤的余数
0.32：在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚相当于0.32g重量单位的磷
2.29：将P换算为P
2O
5的系数
11/ 11。