锰胁迫下美洲商陆CAT, POD活性的变化以及同工酶谱分析专业：生物科学作者：范英姿指导老师：彭喜旭，王海华(湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201)摘要:采用室内培养及生理指标测定方法，研究了不同锰胁迫水平（0.005，0.010，0.015 mol/L）下，美洲商陆幼苗中过氧化氢酶（CAT）活性、CAT和过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化，结果表明：随着锰浓度的增加，美洲商陆幼苗中CAT活性呈一个先增大后降低的趋势，CAT同工酶电泳分析表明，处理和对照中，CAT谱带均为一条，迁移率相同(Rf=0.41)；CA T谱带亮度变化表明，第2d的10000 mmol/L CAT同工酶活性最强，而到第4d美洲商陆CA T活性降低，与CA T紫外光光度计测活性结果一致；POD同工酶电泳分析表明，POD活性变化趋势与和CA T一致，提示在0.005～0.015 mol/L浓度范围的锰胁迫下，美洲商陆的活性氧清除能力增强，而0.015 mol/L时，美洲商陆活性氧清除能力下降。
关键词:锰胁迫；美洲商陆；CA T；POD；同工酶谱分析Manganese to deal with excessive land CAT, POD and changes in the activity of theisozyme spectrum analysisMajor：Life SciencesAuthor: Fan Yingzi Director: Peng Xixu, Wang Haihua(School of Life Science, Hunan University of Science and Technology Xiangtan 411201, Hunan)Abstract: Indoor cultivation and use of physiological indicators of method to study the different stress levels of manganese (0.005,0.010,0.015 mol / L), Phytolacca americana seedlings in the catalase (CAT) activity, CAT and peroxidase (POD) Isozyme bands change, The results showed that: With the increasing concentration of manganese, Phytolacca americana seedlings in the CAT activity increased after the first was a decreasing trend, CAT isoenzyme electrophoresis analysis showed that the treatment and control of, CAT are a band, the same rate of migration (Rf = 0.41); CAT bands brightness changes show that the first 2 d of 10000 mmol / L CAT isozyme of the strongest, and to the first American to land 4 d CAT activity decreased, and CAT ultraviolet spectrometer measurement of results are consistent; POD isoenzyme electrophoresis analysis showed that, POD activity of CAT and consistent with the trend, Tip in the 0.005 ~ 0.015 mol / L manganese concentration of the stress, the Inter-American to land the ability to enhance the removal of reactive oxygen species, and 0.015 mol / L, Phytolacca americana active oxygen scavenging ability.Key words: manganese stress; Phytolacca americana; CAT; POD; isozyme spectrum analysis.前言随着环保意识的增强，人们逐渐认识到土壤重金属污染将对环境和人类健康产生重大影响。
锰是人类和动物必需的微量元素，然而摄入过量的锰则引起锰中毒[1]。
锰对土壤和水体的污染也引起人们的重视[2]。
通过各种途径进入土壤中的锰，在土壤中不断累积，因其不可降解，使治理土壤锰污染变得十分困难，至今尚无找到经济而有效的锰污染治理方法。
近年来，一些能够在地上部大量富集污染物的特殊植物—超积累植物Hyperaccumulator已成为学术界研究的热点[3]。
利用超积累植物清除土壤和水体环境中的金属和类金属污染——植物修复（Phytoremediation）技术以其潜在的高效、廉价及其环境友好性获得了广泛关注[4]，通过种植收割这种植物可有效地清除环境中的锰污染[5]。
近些年国内外关于锰毒及植物耐锰机理的研究成果，并指出了存在的问题和发展前景。
锰毒是酸性土壤上限制作物产量的重要因子，国内外针对锰毒及植物耐受机制进行了相关研究，但进展较为缓慢。
美洲商陆( Phytolacca acinosa Roxb) 属于美洲商陆科多年生草本植物，是一种生物量大、生长快、地理分布广、适应性强的锰超积累植物，在中国的大部分地区都可生长，朝鲜、日本、印度也有分布[6]。
伴随锰超富积植物—美洲商陆在中国的发现，对锰毒及植物耐性机理的深入研究和探讨，将会对植物修复技术的开展产生理论和实践意义。
AOS的种类包括过氧化(H202)、羟自由基(OH-)、超氧阴离子。
H202是一种相对稳定的小分子，能够通过细胞壁和细胞膜运输。
在植物细胞内H2O2若不及时消除，除了其本身的毒性外，，还会与超氧阴离子通过HArber-Weiss反应转化为毒性更大的分子(如OH-) 。
植物中清除H202的抗氧化酶有过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及抗坏血酸－谷胱苷肽循环中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）。
在正常情况下，这些酶性抗氧化剂与非酶性抗氧化剂，如抗坏血酸、谷胱苷肽、半胱氨酸和维生素E 等协同作用，保持细胞内H202等AOS处于相对稳定的低水平状态。
但当植物处于胁迫时，这种平衡可能被打破，导致组织细胞内AOS水平升高。
资料表明，过量锰能够对植物产生锰胁迫效应。
锰胁迫下，植物产生和积累大量的活性氧（AOS）[7]。
过量锰作用下，植物体内超氧化物歧化酶（SOD）、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性的动态变化及其之间的关系,有一些研究,但均未进行深层次的探讨。
大豆试验中[8]，在非致死的锰浓度下，POD、CAT活性随着锰浓度的增加而出现同步增长趋势，当锰达到一定浓度时，两者活性便开始下降，也就是说，POD、CAT的活性会随着锰浓度的升高而表现一定的峰值变化，最终POD、CAT活性达到阙值后开始下降，导致大量活性氧自由基产生,植物开始出现锰毒症状。
然而，在油菜试验中[9]却发现，在不断增加锰浓度的情况下，虽然POD活性和前述一样不断升高，但CAT活性却持续下降，两者呈相反的增长趋势。
美洲商陆属于美洲商陆科多年生草本植物，是一种生物量大、生长快、地理分布广、适应性强的锰超积累植物，在中国的大部分地区都可以生长，朝鲜日本印度也有分布。
草本植物在自然界的长期进化中，形成了一套特有的生理生态机制，因而抗逆性强、分布极为广泛，经常成为锰尾矿废弃地的优势植物。
本实验通过对锰处理后的美洲商陆叶片的CAT，POD酶活性分析，研究锰胁迫下美洲商陆的生理变化，从而有利于揭示植物锰毒的生理机制以及为锰污染土壤的植物修复技术提供资料。
1 材料与方法1.1 材料美洲商陆种子，采自湘潭锰矿，本实验室保藏。
1.2试剂和仪器1.2.1主要化学试剂丙烯酰胺（ACR）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）来自Merckschuchardt公司，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）来自Serva公司，硫酸锰，抗坏血酸（ASA），三羟甲基氨基甲烷（Tris），甘氨酸（Gly），N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED），过硫酸铵（AP），乙二胺四乙酸（EDTA），联苯胺来自上海生化试剂公司，均为分析纯或生化试剂。
1.2.2主要仪器GL20A型全自动高速冷冻离心机（湖南湘仪），UV-1206型紫外分光光度计（日本岛津），AB204-N 电子天平，DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪（北京六一），MV-I型垂板电泳槽（北京六一）。
1.3 美洲商陆幼苗的培养及处理美洲商陆种子用98%的浓硫酸处理40 min，清水充分漂洗，光照培养箱内25°C 下浸种，催芽，约4-5d。
播种于盛有泥沙的瓷盘中，在光照培养箱中，采用Hoagland营养液[10]培养待幼苗长5-6片叶子取幼苗后分别放于盛有营养液（对照），含5 mmol/L，10 mmol/L，15 mmol/L硫酸锰营养液的培养瓶中培养，于处理24 h，48 h，72 h，96 h后取样用紫外分光光度计进行CAT活性测定和CAT，POD同工酶谱分析。
表1 Hoagland完全营养液配方Table 1 Ingredients of Hoagland complete nutrition solution试剂浓度(μmol/L)试剂浓度(μmol/L)Ca(N03)2.4H20KN03 MnC12.4H20 MgS04.4H20KH2PO45×1035×1039.12×1031×103EDTA-FeZnS04.7H20H3BO3CuS04.5H20H2Mo04.H200.1 ×1030.76460.320.51.4 酶液提取1.4.1 提取介质：50 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.0），含1 mmol/L EDTA，1％PVP。
1.4.2 提取步骤：0.5 g叶片液氮研磨，待液氮挥发后，加入10 ml提取介质，研磨2 min，4℃，15000 g离心20 min，上清液直接测定酶活性和同工酶谱分析或液氮速冻后－20℃保存备用。