酯酶同工酶的醋酸萘酯-铁氰化钾染色法的研究
摘要：酯酶可将＠-醋酸萘酯和ß-醋酸萘酯水解生成醋酸和萘酚，利用萘酚能与铁氰化钾反应生成有色物质萘醌的性质可对电泳凝胶上的酯酶同工酶进行染色。
关键词：酯酶同工酶；醋酸萘酯；铁氰化钾；染色法
经典的酯酶同工酶的染色方法的原理是，酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可与坚牢蓝反应生成蓝紫色物质，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出蓝紫色的酶带。
经过摸索，本文介绍一种新的酯酶同工酶的染色方法———醋酸萘酯N 铁氰化钾染色法，其原理是酯酶催化醋酸萘酯水解产生萘酚，而萘酚可被铁氰化钾氧化成萘醌，因而在电泳后的凝胶上含有酯酶同工酶的地方可以染出酶带。
一 材料与方法
1.1实验材料
以新鲜的肉鸡肝脏为材料。
1.2试剂
Acr 为广东省汕头化学试剂厂产品，Bis 、坚牢蓝RR 盐为上海化学试剂公司产品，TEMED 为上海前进试剂厂产品，溴酚蓝为上海试剂三厂产品，＠-醋酸萘酯为上海青浦合成试剂厂产品，ß-醋酸萘酯为上海试剂一厂产品， Tris,HCL,NaCL,2Na HP 4o ,磷酸二氢钠，三氯醋酸，乙醇，甘油，丙酮，丙酮、铁氰化钾、过硫酸铵等均为国产分析纯。
1.3仪器设备
研钵、电泳仪与电泳槽、冰箱、离心机、微量加样器、恒温水浴锅、染色盒、67$紫外光栅分光光度计等。
1.4实验方法
（1）样品制备：取一定量的新鲜鸡肝，按一定比例加入8*9:1的磷酸缓冲液后进行研磨，经4000r/min,15min 离心后取上清液，置于1?冰箱中保存备用。
（2）酯酶活力的测定：参照禹邦超等人的方法进行。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳：参照赵永芳的方法进行。
（4）酯酶同工酶的染色方法有：
经典法：（即醋酸萘酯-固蓝RR 盐染色法）染色液：称取ß-醋酸萘酯与＠-醋酸萘酯、坚牢蓝RR 各200mg ，分别用10mL 丙酮溶解后，混合，再用磷酸缓冲液定容至200mL 。
电泳后，将凝胶条浸入染色液中，于37摄氏度保温直至酶带出现。
染色新法（即醋酸萘酯B 铁氰化钾染色法）染色液G ：仅将经典法染色液中的坚牢蓝RR 除去；染色液B ：4%的铁氰化钾溶液。
电泳后将凝胶条浸入染色液A 中，于37摄氏度保温2min 后弃去染色液A ，用蒸馏水稍加漂洗，再用染色液B 染色，直至显出酶带。
二 结果与讨论
电泳前，将完整的一块凝胶按计划等分为$部份，每部份都按相同的酶活力梯度进行点样。
电泳结束后，将该凝胶按计划等分切为2块凝胶。
1块用经典法进行染色，1块用染色新法进行染色
通过观察实验现象，我们发现这2种染色方法所得的酶谱是相同的。
前文已再次证实鸡
肝中所含蛋白质的种类是很丰富的，这表明酯酶同工酶的这2种染色方法具有相同的专一性。
从图中可以看到，经典法染色易导致背景太暗，给观察酶谱易带来不便，而染色新法的染色背景则较清晰，对酶带的观察不易受到干扰。
从我们所做的实验来看，如果点样量太小，样品的酶活力太低，则染色新法中的快带不易被染出（资料未列出）。
前人在用荧光素双乙酸为底物新建立的灵敏度很高的酯酶同工酶的染色法中也证明，只有在一定的点样量范围内，快带才能被观察到。
所以，我们建议在使用染色新法时要注意样品中酯酶的总活力不能太低，可以在本文图示的酶活力范围内选择使用。
染色新法显带要慢些，在按方法所述加入铁氰化钾溶液后，4min时即染出慢带，至6min 时慢带即较明显，而快带则在8min时可显出，并随时间延长而更加明显。
而经典法显带要快些。
经典法所显酶带可在蒸馏水中于室温下保存达8个月之久而不褪色，染色新法所显酶带在铁氰化钾溶液中于室温下可保存8个月而不褪色，且带不扩散。
由此可见，染色新法可以用价廉易得的铁氰化钾代替较贵的坚牢蓝，并且在一定条件下可以得出与经典法同样的酶谱，故可以在教学与科研工作中发挥其一定的作用。
前人曾就经典法中＠-醋酸萘酯与ß-醋酸萘酯的单独使用及混合使用的效果进行过比较性研究，认为将这2种醋酸萘酯混合使用的效果更好。
我们在用经典法进行实验时也发现混合使用这2种醋酸萘酯染出的酶带更便于观察，故我们采用混合使用这&种醋酸萘酯来进行实验。
目前普遍研究的酯酶其实属于酶组织化学家所称之非特异性酯酶，亦即广义上的酯酶，包括羧酸酯酶（即B-酯酶）、芳基酯酶（即A-酯酶）、乙酰酯酶（即-酯酶）、乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶以及酯酶等。
这类酶对＠-醋酸萘酯和ß-醋酸萘酯都有相同强度的作用，广泛存在于各种生物之中。
前人在研究亚洲玉米螟的酯酶同工酶谱带时发现，当分别用胆碱酯酶的专一性抑制剂毒扁豆碱或羧酸酯酶的专一性抑制剂TPP（磷酸三苯酯）处理电泳后的凝胶板后，再进行染色，所得酶谱均较不使用这些抑制剂时所得酶谱要少了一些酶带。
类似的现象在油菜的酯酶同工酶中也观察到了。
这些资料说明，前人用催化水解＠-醋酸萘酯与ß-醋酸萘酯这一共性来定义广义的酯酶有其合理性，但同时也表明不同的酯酶同工酶也会有其特殊性质。
o染色法，但其染色效果要逊于本文的染前面曾经摸索过酯酶同工酶的醋酸萘酯-KMn
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色新法。
酯酶同工酶的染色方法运用较广，在生物的抗药性机理研究、遗传育种、致毒机理研究、致病机理研究、物种起源关系探索、杂种优势预测等研究工作中均发挥着重要作用。
可见，在基因表达产生的生命状态的直接体现者———蛋白质的结构与功能逐渐成为当前研究阶段中的重点与热的时候，同工酶染色方法的研究在有关酶的功能研究方面仍将发挥其独特的积极作用。
故作者做此摸索。
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