吴青君 女 岁 现在中国农业大学应用化学系攻读博士学位 主要从事农药学和昆虫毒理学研究∀通讯地址 北京海淀区白石桥路 号 中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室∀收稿日期 2 2昆虫几丁质酶及其在植物保护中的应用吴青君 张文吉中国农业大学应用化学系 北京张友军中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京Ινσεχτχηιτινασεανδιτσποτεντιαλυσεινπλαντπροτεχτιον • ± 2 ∏ • 2 ∆επαρτµεντοφΑππλιεδΧηεµιστρψ ΧηιναΑγριχυλτυραλΥνιϖερσιτψ ≤ ≠ ∏2 ∏ Ινστι2τυτεοφςεγεταβλεσανδΦλοωερσ ΧηινεσεΑχαδεµψοφΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ ≤ Αβστραχτ × ∏ 2 ∏ ∏ √ Κεψωορδσ ∏摘 要 本文从生理学!生物化学和分子生物学 个方面综述了昆虫几丁质酶的研究进展 并概述了它在害虫防治!主要是在抗虫育种中作为重要的基因源中的应用∀关键词 几丁质 昆虫几丁质酶 植物保护 应用几丁质是由 )乙酰葡萄胺通过Β) 键连接起来的直链多聚物 是自然界中含量最丰富的多糖之一 在昆虫的外骨骼和肠道内壁 真菌和一些藻类的细胞壁及甲壳动物的外壳中均发现它的存在∀催化水解几丁质的水解酶广泛地存在于含几丁质的有机体及不含几丁质的生物 如微生物!高等植物和动物中∀不同生物源的几丁质酶具有不同的生物功能 昆虫和甲壳动物的几丁质酶主要作用是蜕去外骨骼 真菌几丁质酶负责细胞的生长和分裂 细菌几丁质酶则分解几丁质提供营养源 而植物几丁质酶主要用于防御害虫和病菌的侵袭 增加植物的抗逆能力∀植物在逆境胁迫下体内几丁质酶的含量迅速升高 植物几丁质酶的诱导及防卫反应机制的研究是目前分子生物学研究的热点之一∀大量的植物几丁质酶基因或 ⁄ 被克隆 某些基因已被成功地导入植物中 成为抗病育种中的重要基因源∀几丁质是昆虫表皮独特的组份 昆虫蜕皮时约有 的几丁质被降解≈ 因此 昆虫几丁质及其水解酶对昆虫的生长!发育起重要的作用 人们对它的重视也由来已久 但在总体研究水平上要落后于植物几丁质酶∀进入 年代后 由于相关知识和精密技术不断被引入昆虫学领域 人们对昆虫几丁质酶的物理学!化学!动力学和基因调控特点 以及作为生物农药的发展潜力≈ 主要是在植物抗虫性方面的研究正在不断地探索 并取得了实质性进展∀本文将综述该领域有关方面的主要研究进展∀1昆虫几丁质酶的生理学功能昆虫的蜕皮和变态机制一直是昆虫生理学家研究的重点 早在 年 的一篇专题论文中有关家蚕Βοµβψξµορι解剖学问题中就首次描述过蜕皮液 但人们对蜕皮液的功能认识很模糊 甚至有观点认为它主要用于贮存和释放营养物质≈ ∀直到进入 世纪后才逐渐明确蜕皮液的功能是昆虫在蜕皮前用于消化旧的表皮∀昆虫周期性地蜕去旧表皮并合成新表皮 这一复杂的过程是由旧表皮和表皮层之间累积的蜕皮液中几丁质酶的精确滴度调节的 需要多种类型酶的参与 每种酶又具有多种异构形式∀现已明确的有两种类型的几丁质水解酶∀将从内部裂解 ≤多聚链的酶被称作几丁质酶 ∞≤ 从链的非还原性末端依次切下 ≤单体的酶为Β) )乙酰葡萄胺酶 ∞≤ ∀ ∏ 和 ≈ ∗ 以烟草天蛾Μανδυχασεξτα为模式昆虫 建立的二元酶系统模型较合理地解释了几丁质的水解机制∀首先 不溶性的几丁质被几丁质酶随机裂解为寡糖 这些可溶性的寡糖即成为Β) )乙酰葡萄胺酶的底物 从链末端依次切下几丁质二糖 释放出 ≤ 2 ≤最终又被循环利用参与新表皮的形成∀同时研究发现 这两种酶在分解几丁质中还具有较强的增效活性∀几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶以适宜比例混合 分解几丁质的速度是二者单独作用速度总和的 倍∀除昆虫表皮外 在其肠道组织中也检测到几丁质酶的活性∀肠道几丁质酶具有分解肠道内和围食膜中的几丁质及消化的功能∀昆虫蜕皮过程完成后 肠道几丁质酶能够将蜕皮消化参与合成新的围食膜≈ ∀昆虫蜕皮机制问题的解决 促进了昆虫蜕皮液的生理学和生物化学的发展 其中最主要的几丁质酶和Β) )乙酰葡萄胺酶已被分离纯化 得到 ⁄ 克隆 并有可能用于植物抗虫性的转基因育种研究中∀2昆虫几丁质酶的基因结构及表达2 1昆虫几丁质酶基因的结构昆虫几丁质酶基因的研究最早见于烟草天蛾∀ 年 等≈ 分离得到编码烟草天蛾几丁质酶基因的全长 ⁄ 克隆 并进行了序列分析∀ 由 个核苷酸组成 可译框架含 个核苷酸 起始密码子 × 在 位 终止于 位 所编码的蛋白为 个氨基酸残基 分子量为 ⁄∀其 χ)端非翻译区含有 个核苷酸##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞富含 × 有几个多聚腺苷化信号∀ )末端序列含大量的疏水性氨基酸残基 为信号肽的典型特征∀ 个高度保守的区域分别位于 至 残基 区 和 至 残基 区 区中含有 个天门冬氨酸和 个谷氨酸残基 这些氨基酸残基可能参与底物的结合和对糖苷键的水解∀除以上 个保守区外 在≤)末端区的 至 位之间含大量的苏氨酸和丝氨酸 该区近 的氨基酸残基可作为 )糖基化的受体位点∀除烟草天蛾几丁质酶外 目前对家蚕≈ 和美国白蛾Ηψπηαντριαχυνεα≈ 的几丁质酶基因也进行了 ⁄ 克隆和序列分析及≥ ∏ ∀研究表明 昆虫几丁质酶基因结构的普遍特点是含有多个功能区 包括信号肽区 几丁质酶催化区 富含苏氨酸和丝氨酸的糖基化位点区域及富含半胱氨酸的几丁质结合区∀比较从 ⁄ 推断得出的相应蛋白质的氨基酸序列发现 家蚕和美国白蛾的几丁质酶氨基酸的同源性为 家蚕和烟草天蛾为 美国白蛾和烟草天蛾为 ∀ 种昆虫中均含有 ∗ 和 ∗ 位的 )糖基化位点 且处于相同的位置 而第三个糖基化位点 烟草天蛾在 ∗ 位 家蚕在 ∗ 位 分别处于不同的位置 而美国白蛾不含有该位点∀与其基因结构的多功能区相一致的是所编码蛋白的多区结构性∀对烟草天蛾的基因组克隆的分析发现 在跨越 的区域至少由 个外显子组成≈ 这一系列的外显子同已明确的蛋白质结构 功能区相一致∀例如 外显子 有起始密码子和编码 个氨基酸的信号肽 外显子 始于几丁质酶成熟的氨基末端序列 ⁄≥ ∂ 外显子 包括编码一个保守区的序列 ƒ ∂ • ∞ƒ 为部分催化位点 外显子 含有另一保守区序列 ≠⁄ƒ⁄ ⁄ ⁄2•∞≠ 外显子 有一终止密码子和编码 核苷酸的非翻译区 几个可能的 )糖基化和磷酸化区域 一个富含苏氨酸和丝氨酸的区域 富含半胱氨酸的区域和一个羧基末端区∀比较昆虫!线虫!细菌!哺乳动物和高等植物的几丁质酶氨基酸序列 发现大多数的保守序列位于中央区域 它包含两个催化活性区域∀烟草天蛾几丁质酶的氨基酸序列与植物几丁质酶≤ 和≤ 的相似性较少 但与≤ 和≤ 类植物几丁质酶以及细菌几丁质酶却有一些相似之处 特别是两个高度保守的区域≈ ∀昆虫!线虫和人类的几丁质酶中有富含半胱氨酸的羧基区 而其它生物体的几丁质酶中却没有≈ ∀2 2昆虫几丁质酶的表达在幼虫取食阶段 昆虫几丁质酶基因是没有活性的 它的表达仅是在幼虫 幼虫!幼虫 蛹和蛹 成虫蜕皮前的短暂时间内表达 且在蜕皮前达到高峰∀该基因的活性受蜕皮激素的正调节 但受保幼激素的负调节≈ ∀几丁质酶基因的瞬时表达和激素调节的特征表明 该酶在不适宜的时期内表达或在适宜的时期内不表达 对昆虫的生长都是非常不利的∀同样 在植物绿色组织中几丁质酶通常是不表达的 但受病菌!昆虫或其它逆境胁迫情况下可诱导产生几丁质酶 所以植物或微生物连续表达昆虫或植物的几丁质酶可以对昆虫或真菌产生抵抗力≈ ∀3昆虫几丁质酶在植物保护中的应用几丁质水解酶作为对含几丁质的有害生物 如昆虫!线虫和真菌的一种防御机制而不断受到人们的关注 它能够降解外侵生物的完整结构 如围食膜或昆虫表皮!卵壳或线虫的外壳!真菌的细胞壁 或释放出能诱导寄主产生其它防御反应的物质而对入侵的生物产生抗性∀昆虫!线虫!真菌!病毒和其它生物体利用几丁质酶蜕皮或穿透结构屏障 这在害虫综合治理中 以几丁质酶为靶标制订出选择性的有效措施是很有用的∀3 1昆虫几丁质酶在植物基因工程中的应用⁄ 等≈ 采用根瘤农杆菌介导的转移技术将烟草天蛾几丁质酶的嵌合基因引入烟草和番茄植物 通过免疫印迹分析显示 ×植物能表达该几丁质酶基因∀为了确定其抗虫特性 从##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞转昆虫几丁质酶基因烟草!细菌和普通植物中提取纯化几丁质酶 以 ∗ 水平拌入粉碎的小麦饲料中 饲喂一种小甲虫))市场锯谷盗Ορψζαεπηιλυσµερχατορ的初孵幼虫∀结果取食细菌和普通植物几丁质酶的幼虫 生长和死亡率与取食未处理饲料的幼虫一样 而所有取食含重组昆虫几丁质酶饲料的幼虫在孵化几天后即死亡 说明昆虫几丁质酶是转基因植物的抗虫因子≈ ∗ ∀此外 实验室的研究人员正努力将昆虫几丁质酶导入水稻!玉米和高粱等农作物中 以提高其抗耐害物的能力∀同时 通过制作昆虫几丁质酶的缺失子和突变形式来确定影响其活性稳定性和几丁质基质亲和力的区域 并利用昆虫几丁质酶和其它杀虫基因的重组提高酶的表达水平和扩大靶标害虫的范围∀3 2昆虫几丁质酶对苏云金杆菌 的增效作用早在 年代 人们就发现几丁质酶与微生物杀虫剂之间的增效作用∀例如细菌几丁质酶能够增加细菌! 和核多角体病毒的活性∀用几丁质酶和 的混合物饲喂烟草天蛾 其杀虫速度明显高于单喂几丁质酶或 对核多角体病毒的杀虫活性提高 倍∀昆虫几丁质酶对 的增效作用也得到证实≈ ∀将转昆虫几丁质酶基因的烟草和对照烟草叶片在 毒素溶液中浸渍 秒 接入夜蛾幼虫 结果显示 转基因植物叶片上的幼虫对叶片的危害程度和生物量均显著降低∀4结束语几丁质在昆虫生长的每一阶段都必须维持在一定的水平 过量或缺乏都将对昆虫造成致命的影响∀通过调节昆虫表皮和围食膜中几丁质的完整性和 或含量 是很好的害虫防治策略 加之高等动物和植物均不含有几丁质 以其为靶标的杀虫剂对其它生物体相对安全 因此围绕几丁质设计开发新型农药品种 其前景应是极为广阔∀几丁质水解酶具有独特的选择活性 同时它能够增加其它杀虫剂的毒力或促进对其它杀虫剂的吸收 这些特点也应充分用于害虫的防治策略中∀生物技术的发展使基因操作成为可能 使用基因工程手段培育抗虫作物品种是农业发展的一个方向≈ ∀将抗虫基因引入到农作物的细胞中 并使其在寄主细胞内稳定的遗传和表达 从而形成抗虫新品系∀这种被称为转基因植物农药 的特殊农药≈ 因其诸多优点和巨大的潜在经济效益而日益受到国内外的重视和关注∀昆虫几丁质酶基因作为一个独特的基因源 也逐步纳入农业生物技术人员的研究轨迹 虽然仍处于探索阶段 但对其结构和调节特性的深入了解 将会对害虫防治措施提供更直接有力的信息∀参考文献• Βιοχηεµ ϑ 83 ∗∏ ∏ ≥ ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ 27 ∗≥ ∞ ≥ ∏ Αδϖ ΙνσεχτΠηψσιολ26 ∗ƒ∏ × ΙνσεχτΒιοχηεµ 15 ∗ƒ∏ × ΙνσεχτΒιοχηεµ 15 ∗≤ ∏ ≤ εταλ ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ 23 ∗⁄ ≥ ≠ ≠ εταλ ΙνσεχτΒιοχηιεµ Μολ Βιολ 27 ∗≥ ≥ • ≥ εταλ ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ 28 ∗≤ ≤ εταλ ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ 27 ∗≤ ° ⁄ ⁄ ≥ √ 2• ∏ ≤ ≥ ⁄ εταλ Βιο Τεχη2νολ 13 ∗⁄ ÷ ° ⁄ ⁄ ≥ √• ÷ ⁄ ÷ εταλ ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ 26 ∗⁄ ÷ εταλ Τρανσγεν Ρεσ 7 ∗∞ ∏ ≤ ⁄ εταλ ΝατυρεΒιοτεχη 15 ∗傅桂平 张子明 农药科学与管理 18 ∗##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞。