Synthesis
Genetic modifications
Molecular biology Recombinant DNA technology •Cloning •Transformation
Design
Future modifications
Analysis
Metabolic characterization
第一个生产厂 ：“瓶工厂” Prizer公司：深层发酵法青霉素的商业化生产 纯培养阶段和深层通气培养阶段的产品特点：不存 在严格的代谢调控机制。
代谢控制育种发酵时期
随着人们对微生物中各种产物的生物合成途 径的深入了解（合成途径及调控机制、酶学性质 等），可以利用传统诱变技术和定向筛选技术得 到解除代谢调控的生产菌。 • 这一时期发酵产品得到极大的扩展，大部分产品 的生物合成途径中存在严格的代谢调控机制。
Penicillicum chrysogenum
细胞在消耗ATP的情况下，泵出质子(主动运输过程）
苯氧乙酸、rglu
、
高浓度有机酸造成ATP泄漏!
r氧
Ycell/glu
[ H ][ A ] 10 pH cdiss Ka HA cundiss
( pK a pH )
P20 能量泄漏的数据
Interpretation of the analysis Suggestions for further modifications
Fermentation physiology Metabolic pathway analysis Analytical techniques •Expression analysis (DNA arrays) •Protein analysis •Metabolite levels •Flux analysis
纯培养技术发明：
1881年，德国细菌学家科赫发明了营养明胶上划线以 分离细菌纯种的方法，后经其助手海斯夫人的建议，改用 更实用的琼脂来取代明胶，从而有力地推动了纯种分离技 术的发展。
通气培养时期
• 1942年，由于第二次世界大战中救护伤员的迫 切需要，推动了青霉素深层液体发酵技术的发 展，同时将生物反应器的设计、通气搅拌技术 引入发酵工业，并导致在发酵工程中具有革命 性和普遍意义的生物反应器技术的建立。
• 自由扩散（被动运输）
相间扩散 膜内扩散 相间扩散
• 促进扩散（被动运输） P16表2.2 一些化合物的运输类型 （细菌与真菌） • 主动运输
自由扩散的特点
运输速率与膜两侧物质浓度差、被输送物质的分 子大小、电荷、其在膜中溶解性、膜厚度有关 熵增过程，不需能量、自发进行 无专一性，具有方向性：顺浓度梯度 Dmem K par (ca cb ) 速率遵从费克第一定律：J P(ca cb )
体外基因重组技术
• 1973年，美国斯坦福大学医学院的科恩和博耶等人将 大肠杆菌中两种不同特性的质粒片段用内切酶和连接 酶进行剪切和拼接，获得了第一个重组质粒，然后通 过转化技术将它引入大肠杆菌细胞中进行复制，并发 现它能表达原先两个亲本质粒的遗传信息，从而开创 了遗传工程的新纪元。 • 对代谢途径中的特定的酶反应进行精确的修饰（控制 酶的质与量）,成为代谢工程的重要技术基础。
反向代谢工程的研究方法和工具
代谢工程的科学意义
确定细胞的基因型与表型关系
基因型：所有基因的组合 表 型：基因型所表达的功能 基因型决定表型 表型还受到环境的影响 细胞优化：确定基因型对目标表型的贡献度 环境优化：确定环境因素对目标表型的贡献度
代谢工程和系统生物学阶段
Ideker et al. Annu. Rev. Genomics HUM. Genet.2001. 2:343-73 A new approach to decoding life: systems biology
系统生物学是运用生物的、遗传的、化学的及物理的方法对生物系统进行 扰动从而对生物系统产生的响应进行研究，其需要检测基因、蛋白质、代 谢物及信号途径的响应，进而对所得信息、数据进行综合，构建描述系统 结构及其响应于上述各种扰动的数学模型。最终通过该模型来进行准确的 预测。 细胞反应网络、调控网络、信号转导网络、蛋白互作网络以及动力学模型 描述单个细胞系统的模型……计算机中的细胞 科学意义：细胞的各个部分如何有机的整合成一体，这个系统如何保证 细胞的“有效性”。
r Jacell Pacell (ca cb )
d mem
P 渗透系数：单位浓度差单位时间单位界面积的传递量
疏水性小分子>不带电荷的极性小分子>不带电荷的极性大分子>离子
O2 、N2 等
脲、H2O、CO2、甘油
葡萄糖 蔗糖
H+ 等
An example:有机酸的自由扩散
HA H+
pK a pH
ctotal cundiss cdiss 10 (1) pH pK a 1 10 At pseudo-steady conditions: rHA,in rA ,out PHA（ a cHA,extra cHA,int ra ) PA- a (cA- ,int ra cA- ,ex t ra ) (2) PA- a[(ctotal,intra cHA,int ra ) (ctotal,extra cHA,ex t ra )] ctotal ,intra ctotal ,extra ctotal ,intra ctotal ,extra 1 10 pHintra pKa 1 10 pHint ra pK a PHA PApH extra pK a pK a pH extra 1 10 1 10 PHA PA- 10 pHint ra pK a 1 10 pHintra pKa 1 10 pH extra pKa (3) (4)
• 代谢工程定义：利用DNA重组技术对特定的生 化反应进行修饰或引入新的反应以定向改进产 物的生成或细胞的性质。Rational method • 代谢工程方法顺利实施的焦点是精确定向，其 最显著的特点是全面系统的分析（MFA、MCA、 动力学模型），为了完成分析的任务，其实验 部分需要用到各种分析方法。代谢工程的发展 是和分析技术的发展紧密相结合的。
2.细胞生长中的反应类型
• 运输反应：底物的输入、代谢产物及酶的输出 • 产能反应：属于分解代谢反应，将底物分解、转化 为前体代谢物(12种），为生物质的合成提供基本 的碳骨架、能量（ATP）和还原力（NADH、NADPH） • 生物合成反应：由前体代谢物到构造单元（氨基酸、 核苷酸、磷脂、肽聚糖等）、辅酶、信号分子。合 成代谢反应 • 聚合反应：由构造单元到生物大分子（蛋白质、 DNA、RNA等）。合成代谢反应 • 装配反应：由生物大分子到细胞结构（细胞壁、膜、 核、鞭毛等） • 基因表达及其调节过程、信号转导过程：对细胞功 能进行总体控制
• 运输速率符合饱和型动力学：速率在低底物浓度是一 级，高浓度为0级（不变） P22 速率公式的推导
• 常见于真菌中，细菌中很少有这种运输方式（E.coli 甘油、 Zynomonas mobilis 葡萄糖、真菌糖类）
Porin
A bacterium like E. coli （outer membrane） can have up to 105 copies of porins OmpF, OmpC, or PhoE, which tend to form a barrel of antiparallel β-sheets, consisting of trimeric complexes of identical subunits of ca. 35 kDa, with an approximate diameter of 1 nm that allows the passage for molecules up to a mass of about 600 Da.
进一步扩展了生物基工业产品的种类（各种治疗蛋白、疫苗） 早期的工程菌构建策略比较简单，通过已有的生化知识和局 部分析可以推断出需要操作的目标基因（如何避免盲目性？） 基因工程技术和代谢控制育种相结合
代谢工程和系统生物学阶段
Bailey, J.E.(1991) Science, 252,1668-1674, “Toward a Science of Metabolic Engineering”:
Macromolecules
Secretion Assembly reactions
P11
Proteins
的运输反应
Modification of transport systems can result in the improvement of several cellular properties including: increasing the range of carbon source utilization increasing metabolic precursor availability for the synthesis of amino acids, shikimate pathway intermediates, TCA cycle intermediates, and fermentation products like ethanol increasing the efficiency in sugar mixture utilization by partial disruption of catabolic repression controlling overflow metabolism, thus reducing acetate production
1 10 10 6.13.1 1 10
7.13.1