实验概要
通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；了解柱层析和薄层色谱分离的基本原理，掌握柱层析和薄层色谱分离的操作技术。

通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

实验原理
层析法是一种物理分离方法。

柱层析法是层析方法中的一个类型，分为吸附柱层析法和分配柱层析法。

本实验仅介绍吸附柱层析法。

吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。

它是根据混合物中各组分的分子结构和性质（极性）来选择合适的吸附剂和洗脱剂，从而利用吸附剂对各组分吸附能力的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能不同达到分离目的。

吸附柱层析法通常是在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂（常用的吸附剂有氧化铝、硅胶等）。

当混合物溶液流过吸附柱时，各组分同时被吸附在柱的上端，然后从柱顶不断加入溶剂（洗脱剂）洗脱。

由于不同化合物吸附能力不同，从而随着溶剂下移的速度不同，于是混合物中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱顺序在柱中自上而下形成了若干色带。

在洗脱过程中，柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。

被吸附的组分被溶解吸出来，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，把组分从溶液中吸附出来，而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动，这样经过适当时间移动后，各种组分就可以完全分开，继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止，分别收集各组分。

绿色植物如菠菜叶中的叶绿体含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类天然色素。

这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。

H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C
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别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。

它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。

植物中叶绿素a 的含量通常是b 的3 倍。

尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。

H56）是具有长链结构的共轭多烯。

它有三种异构体，即a-胡萝卜素、β-胡萝胡萝卜素（C
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卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。

在生物体内，β-胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素A。

目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A 使用，也可作为食品工业中的色素。

H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。

叶黄素（C
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与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。

石油醚是一种脂溶性很强的有机溶剂。

叶绿体中的四种色素在石油醚中的溶解度是不同的：溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。

溶解度最
高的是胡萝卜素，它随石油醚在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；叶绿素b的溶解度最低，扩散得最慢。

这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。

同样，提取液可用色层分析的原理加以分离。

因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离菠菜中胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。

主要试剂
1. 硅胶G
2. 中性氧化铝
3. 甲醇
4. 石油醚（60-90 ℃）
5. 丙酮
6. 乙酸乙酯
主要设备
1. 研钵
2. 布氏漏斗
3. 圆底烧瓶
4. 直形冷凝管
5. 色谱柱
6. 抽滤瓶
7. 烧杯
8. 铁架台
9. 脱脂棉723分光光度计
实验材料
菠菜叶
实验步骤
1. 菠菜色素的提取
取2g 新鲜菠菜叶，与10mL 甲醇拌匀研磨5 分钟，弃去滤液。

残渣用10mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液进行提取，共提取两次。

合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。

2. 薄层层析
将上述的浓缩液点在硅胶G 的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。

3. 柱层析
取3g 中性氧化铝进行湿法装柱。

填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，依次接收个色素带，即得胡萝卜素（橙黄色溶液）、叶黄素（黄色溶液）、叶绿素a（蓝绿色溶液）以及叶绿素b（黄绿色溶液）。

称取12g碱性三氧化二铝加入30mL石油醚搅拌，浸泡10min。

在层析柱内加入一团棉花（棉花要尽量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。

用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。

样品的分离层析
将浓缩液小心地从柱顶部加入。

加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醚冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前，在柱顶小心加入约1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脱剂，层析即开始进行。

当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的烧杯收集，得黄色溶液，即胡萝卜素。

将洗脱剂换成1：7的石油醚-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素a和叶黄素。

注意事项
1. 选材时要注意选取新鲜、颜色深的叶片。

2. 用丙酮和层析液都是易挥发且有一定毒性的有机溶剂，所以研磨时要快，收集的滤液要用棉塞塞住，层析时要加盖，减少有机溶剂的挥发。

3. 在研磨时加入少许SiO2，目的是为了研磨得充分；加入少许CaCO3的目的是为了防止研磨时叶绿体中色素受到破坏；加入丙酮的目的是作为叶绿体中色素的溶剂。

4. 研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。

5. 过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当。

6. 叶绿素要避光保存。

叶黄素易溶于醇而在石油醚中溶解度较小，从嫩绿菠菜得到的提取液中，叶黄素含量很少，柱色谱中不易分出黄色带。

7. 萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。

8. 为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。

因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。

9. 在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。

10. 层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。

11. 注意洗脱剂的配比，胡萝卜素出来后，换成1：7的洗脱液。

12. 洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。

因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80滴为宜。

13. 样品一定要足够浓缩，加样量不要过大或过小。