（最好能有时间过过ppt）生物分离工程第一章绪论1.定义：生产粗原料的过程及其之后的目标产物的分离纯化过程，即下游加工过程；2.下游加工过程：目标产物的分离纯化。

包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等3.特点及其重要性：(1)发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液；(2)培养液是多组分的混合物；(3)生化产物的稳定性差——易引起产物失活；(4)对最终产品的质量要求很高。

4.下游加工过程的一般流程:(1)下游加工过程的一般流程;（2）初步纯化;（3）高度纯化与精制;（4）成品加工5.分离效率的评价:目标产品的浓缩程度/分离纯化程度/回收率6.提高回收率的方法：（1）提高每步回收率 ，（2）减少操作步骤；（3）开发新型高效的分离方法第二章发酵液预处理和固液分离首先要进行培养液的预处理和固液分离，才能进行后续操作：对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。

对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。

1.发酵液的基本特性：发酵产物浓度较低，大多为1-10%；悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体，不易过滤；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动成分复杂，杂质较多。

2.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度；⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作；⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。

3.预处理手段：絮凝与凝聚处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。

常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。

其余手段：加热，调节pH。

凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm），机理：1）中和粒子表面电荷; 2）消除双电层结构;3）破坏水化膜。

胶体双电层结构：发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。

正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。

对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。

电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升），称为凝聚价或凝聚值。

Schulze－Hardy法则（叔采-哈代）：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。

絮凝：使用絮凝剂（天然和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。

絮凝剂主要起架桥作用。

机理：架桥作用。

4.加热作用：发酵液预处理最简单最常用的方法。

加热能改善发酵液的操作特性。

只适用于对热较稳定的液体。

注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。

5.影响发酵液固液分离的因素：1）发酵液中悬浮粒子的大小；2）发酵液的黏度viscosity，粘度越大，固液分离越困难。

6.板框压滤机：其过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。

1）广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。

适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。

2）板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。

滤饼充满滤框后停止过滤。

3）优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。

它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。

4）缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。

7.错流过滤原理：液体的流向和滤膜相切。

在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。

目前适用于小分子的分离。

特点：收率高（97-98%）、质量好、减少处理步聚、染菌罐也能进行处理、介质阻力大、不能得到干滤饼、需要大的膜面积。

8.离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。

离心机的种类：A.按速度和离心力分：1）常速离心机：最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2）高速（冷冻）离心机：1×104-2.5×104rpm，相对离心力104~105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3）超速离心机：转速2.5-8×104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化等。

B.按离心机的作用方式分：1）斜角式离心机：结构稳定，可装载较多的样品，使用较高的转速。

加速或减速时，对样品有搅动。

有些梯度离心要求用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差。

2）平抛式离心机：常用的低中速离心机，样品便于收集，受振动和变速搅乱后对流现象小，但转头结构复杂，最高转速相对要低。

容量也小一些。

３）管式离心机：结构简单，可提供较大离心力，转速高，分离因数高达15000-65000。

管状离心机可以冷却，有利蛋白质分离间歇操作，须定时拆卸、清洗。

适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。

4）碟片式离心机：分三类：人工排渣的碟片离心机、喷嘴排渣的碟片离心机、活门（活塞）排渣的碟片离心机。

5）螺旋式离心机：用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。

6）多室式离心机：常用于抗菌素液－液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。

第三章细胞破碎1.细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。

2.细胞破碎方法：A。

机械法：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

机械破碎特点：1）处理量大，破碎快，时间短，效率较高，工业规模的重要手段；2）作用力：挤压，剪切和撞击作用；3）在许多情况下，细胞内含物全部释放出来；4）由于机械搅拌产生热量，破碎要采用冷却措施。

高压匀浆法原理：利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速撞击造成细胞破裂，在高压匀浆器中，细胞经历了高速造成的剪切、碰撞和由高压到常压的突变，从而造成细胞壁的破坏，细胞膜随之破裂，胞内产物得到释放；珠磨破碎法原理：细胞悬浮液与玻璃珠（或石英砂，或氧化铝）一起高速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎；撞击破碎法（X-press）原理：将细胞冷冻(-25℃至-30℃) 使其成为刚性球体，可降低破碎的难度；超声波破碎法机理：在超声波作用下液体发生空化作用,液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。

B。

物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

渗透压冲击法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞，引起细胞壁和膜膨胀破裂，从而使细胞通透性增大；冷冻－融化法：通过水结晶的形成和随后的融化而进行细胞破碎。

C。

化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。

化学渗透法：某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。

D。

酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎（生物法）。

3.胞内产物的选择性释放原则：（1）破坏或破碎存在目标产物的位置。

如：存在于膜附近时，可采用温和的方法，如酶溶法，渗透压冲击法和冻结—融化法；存在于细胞质内时，只能采用强烈的机械破碎法。

（2）选择性溶解目标产物：当目标物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和力的试剂使目标物易于释放，其他杂质不易溶出。

同时可采用生化集成。

4.包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。

目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。

其形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。

包涵体的钝化方法：收集菌体细胞——细胞破碎——包涵体的洗涤——目标蛋白的变性溶解——目标蛋白的复姓。

第四章 沉淀法1.沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。

2. 根据所加入的沉淀剂的不同，可分为：（1） 盐析法（2）等电点沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）非离子型聚合物沉淀法（5）聚电解质沉淀法（6）复合盐沉淀法（7）亲和沉淀法（8）选择性沉淀法。

3.盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

机理：（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。

（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。

（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4. 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。

（2）“盐析”现象—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。

5. 有机溶剂沉淀原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

6.等电点沉淀原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH 值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

第五章 膜分离1.膜分离技术：电渗析（ED ） ：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；2. 浓差极化定义：在操作过程中，由于膜的选择透过性，被截留组分在膜料液侧表面积累形成浓度边界层，其浓度大大高于料液的主体浓度，在膜表面与主体料液之间浓度差的作用下，将导致溶质从膜表面向主体的反向扩散。