2011年4月Vo.l 29No .4April 2011Chi n ese Journal of Chromatography358~361研究论文DOI :10.3724/SP .J .1123.2011.00358*通讯联系人:张秀莉,副研究员,主要研究天然小分子和多肽的分离分析.Te :l (0411)84379521,E m ai:l zhangx i uli @dicp .ac .cn .基金项目:重大新药创制专项(N o .2009ZX 09313 003)和国家自然科学基金面上项目(No .30801513).收稿日期:2010 12 08高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率蔡晓明1, 张 岩2, 于 龙1, 郭志谋1, 张秀莉1*, 梁鑫淼1(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析重点实验室,辽宁大连116023;2.Un ivers ity of C alifon ia Irvi ne ,CA 92697 4625,USA )摘要:采用高效亲和色谱技术(HPAC )对中药成分与人血清白蛋白(HSA )的相互作用进行了研究。

首先采用点击化学的方法制备了表面键合有HSA 蛋白的硅胶固定相并装填成亲和色谱柱,根据药物在该色谱柱上与空白硅胶柱上的保留时间差计算得到药物与蛋白的结合率。

利用该方法测得模型化合物华法令与H SA 的结合率与文献中采用超滤法测得的结果基本一致,表明该方法可用于测定药物与HSA 的结合率。

在此基础上用该方法测定了葛根素和告依春两种中药成分与HSA 的相对结合率分别为10 26%和10 20%。

同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率为14 25%。

结果表明,HPAC 可以作为研究药物与蛋白相互作用的一种简便可行的方法,其测定结果与超滤方法一致。

关键词:高效亲和色谱法;人血清白蛋白;葛根素;告依春;结合率;超滤中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000 8713(2011)04 0358 04Detection of drug hu m an seru m albu m in b ind i ng ratios of t woCh i nese m edici nal ingred ients by h igh perfor m anceaffinity chro matographyCAI Xiao m i n g 1,Z HANG Yan 2,YU Long 1,GUO Zhi m ou 1,ZHANG X iuli 1*,LI ANG X in m iao1(1.CAS K ey L abora tory of Sepa ra tion Sc ien ce for An a ly tica l Che m istry ,D a lian In stitu te o fChe m ica l Phy sics,Chin ese Acade m y o f Scie n ces,Da lian 116023,Ch i n a;2.Un iver sity o f Ca lifon ia Ir vin e,CA 92697 4625,U SA )A bstract :The i n teraction of t wo Chinese m edici n al i n gredi e nts and hum an seru m al b u m in (HSA )has been investigat ed by high perf or m ance affi n it y chro m atography (HPAC ).HSA bounded silica based stati o nary phase w as prepared based on t he click chem istry strategy ,and packed in a colu m n (nam ed as HSA col u m n).The drug HSA binding rati o was calculated fro m t he diff erence of t he drug s ret enti o n ti m es on the H SA colu m n and silica col u m n (blank col u m n).T he warfari n HSA bindi n g rati o det er m ined by t his m ethod was s i m ilar to t he refer ence reported value by ultrafiltration m et hod .The results i n dicat ed that the new HSA colu m n and t he HPAC m et hod can be used for t he detection of binding ratio of drug and HSA .T he bi n di n g ratios of puerari n and goitri n deter m i n ed by the HPAC m ethod were 10 26%and 10 20%,respecti v e l y .And the binding rati o of puerarin deter m i n ed by ultrafiltrati o n was 14 25%.A ll t hese results showed t hat HPAC is a usef ul m et hod t o i n vestigate the interacti o n bet ween drugs and protein .K ey words :high perf or m ance affinity chro m atography (HPAC);hu m an seru m albu m i n ;puer ari n ;goitrin ;binding ratio ;ultrafiltration 人血清白蛋白(hu m an seru m albu m in ,HSA)是由585个氨基酸残基组成的一条单肽链,相对分子质量约为66500,是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白[1]。

H SA 上有多个药物结合位点,药物进入血浆后,首先与血清白蛋白结合,然后再被输送到身体的各个部位产生药效。

药物进入体内后的许多重第4期蔡晓明,等:高效亲和色谱法测定2种中药成分与人血清白蛋白的结合率要的药动学参数(包括药物的代谢、排泄、分布、扩散等)都与药物和蛋白的结合率有关,因此药物与蛋白的结合率影响着药物在体内的药动学及药效学结果,测定药物 蛋白结合率对临床用药具有重要意义[2]。

由此可见,在中药的现代化过程中,研究中药有效成分与血清白蛋白间的相互作用,对于提高中药用药的科学性,了解中药药物分子在体内的转运和代谢等具有特别重要的意义[3]。

文献[4]采用高效亲和色谱法(hi g h perfor m ance affi n it y chro m atography ,HPAC)测定了丹皮酚与固定化人血清白蛋白的结合域。

葛根素[5](图1a)和告依春[6](图1b)分别是中药葛根和板蓝根中的主要成分,本文利用HPAC 方法,以HSA 为为固定相,测定了葛根素与告依春两种中药成分与H SA 的结合率,同时用超滤的方法测定了葛根素与H SA 的结合率,并将两种方法测得的值进行比较。

图1 (a)葛根素与(b)告依春的结构Fig .1 Stru ct ures of (a)puerarin and (b)goitrin1 实验部分1.1 仪器与试剂HP 1100高效液相色谱仪(美国Ag ilent 公司),包括G 1310A 四元梯度泵、G 1314A 二极管阵列检测器;M illi Q 纯水系统(M illi p ore ,USA);Ther m o868系列pH 计(美国热电集团)。

色谱数据通过HP 工作站采集和获得。

人血清白蛋白购自Sig m a 公司;葛根素购自西安山川生物技术公司;告依春为本实验室从板蓝根中经工业色谱分离纯化得到;华法令购自武汉远程科技发展有限公司;磷酸氢二钠与磷酸二氢钠购自北京精求化工厂,分析纯;水为超纯水。

1.2 溶液配制磷酸缓冲液:按7 3的比例称取Na 2HPO 4 12H 2O 和N a H 2PO 4 2H 2O 用超纯水配成0 067m ol/L 的缓冲液,并用N aOH 调节pH 至7 4。

HSA 模型化合物溶液:取华法令适量用磷酸缓冲液配制成10 m ol/L 的溶液。

样品溶液:取葛根素和告依春适量用磷酸缓冲液分别配制成3 m ol/L 和5m ol/L 的溶液。

所配制的溶液均于4 保存。

1.3 色谱条件所采用的HSA 色谱柱及空白柱(4 6mm 150mm )为本实验室采用click chem istry [7]方法制备得到,H SA 色谱柱的制备过程见图2,空白柱为未键合H SA 的叠氮硅胶柱。

流动相为0 067m ol/L 的磷酸缓冲液(pH 7 4),过0 45 m 膜。

葛根素和告依春分析时采用0 6mL /m i n 的流速,华法令分析时采用1 5m L /m in 的流速。

柱温为37 。

进样量为5 L 。

葛根素的检测波长为254n m,告依春为280n m,华法令为308n m 。

图2 HSA 亲和色谱柱的制备Fig .2 P reparation strategy of t he H SA st ati onary phase1.4 超滤实验取20m g H SA 于0 25mL 磷酸缓冲液中,与0 25mL 浓度为1 5 m ol/L 的葛根素溶液混合并振摇,混合后HSA 及葛根素的浓度分别为630 m ol/L 和0 75 m ol/L ,其中HSA 的浓度与人血清中的白蛋白浓度一致。

将混合溶液在37 孵育30m i n 后移取至规格为1 5m L 的超滤装置中离心30m i n (10000r/m in),超滤膜截留相对分子质量为3kD a 。

滤液中葛根素的含量经高效液相色谱(HPLC)分析测定。

为了消除超滤膜对药物的吸附对测定结果的干扰,取0 5mL 浓度为0 75 m ol/L 的葛根素溶液直接在37 孵育30m i n 后移取至超滤装置中离心30m i n (10000r/m i n ),滤液用HPLC 分析。