木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。
供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。
淀粉酶活力测定实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小一、目的淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。
小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。
因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。
通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25Ml15支（5）试管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2.试剂（1）1%淀粉溶液（2）0.4mol/L氢氧化钠（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A液。
称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。
取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。
3.材料萌发3天的小麦芽。
四、操作步骤1.酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1次，提取20min。
3000r／min离心l0min，转出上清液备用。
2.a-淀粉酶活力测定（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。
（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。
取出后迅速用流水冷却。
（3）在对照管中加入4m10.4mol/L氢氧化钠。
（4）在4支试管中各加入1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（5）将4支试管置另一个40℃士0.5℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。
取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。
3.淀粉酶总活力测定取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。
另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。
然后加入稀释之酶液lml。
在对照管中加入4m10.4mol氢氧化钠。
4支试管中各加1mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。
以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。
4.麦芽糖的测定（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。
分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂2.0m1，置沸水浴中加热5min。
取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1。
混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。
以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中，各加入2m13,5-二硝基水杨酸试剂。
以下操作同标准曲线制作。
根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。
（A—A0）xVT五、结果处理式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；VT为样品稀释总体积（ml）；VU为比色时所用样品液体积（ml）；W为样品重（g）。
六、注意事项（1）酶反应时间应准确计算。
（2）试剂加入按规定顺序进行。
七、思考题1.淀粉酶活性测定原理是什么？2.酶反应中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40℃进行保温？3.测定酶活力，应注意什么问题？一、目的淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。
淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。
小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。
因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。
通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。
二、原理淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。
不同来源的淀粉酶，性质有所不同。
植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。
Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。
β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6键时停止。
单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。
β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min 可使其钝化。
通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。
可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出β-淀粉酶活力。
淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。
还原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。
以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。
三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）电子顶载天平（2）研钵（3）容量瓶100mL2个（4）具塞刻度试管25Ml15支（5）试管8支（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支（7）离心机（8）离心管（9）恒温水浴锅（10）分光光度计2.试剂（1）1%淀粉溶液（2）0.4mol/L氢氧化钠（3）pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容至1000mL，为A液。
称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000mL，为B液。
取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml ，盖紧瓶塞，防止CO2进入。
（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。