胡萝卜素愈伤组织培养开题报告 1011421130 徐亮
1、本论文课题国内外概况和文献综述：
应用细胞的全能性(totipotency)理论，即已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，可以将成熟胡萝卜直根的部分组织培养成完整胡萝卜植株。
国内外研究者在探讨胡萝卜愈伤组织的成因时，发现影响胡萝卜愈伤组织的发生频率主要有基因型、外植体、培养基、激素等因素。
胡萝卜的基因型是影响其离体培养再生能力的重要因素。
对于不同品种的胡萝卜种子,大多数研究者认为利用其刚萌发的无菌苗的下胚轴诱导愈伤组织，出愈率较高
[1-3]。
同一基因型的不同外植体其愈伤组织的发生能力有明显差异，这与不同外植体的分化程度和脱分化能力不同有关。
近年来的研究表明，以胡萝卜下胚轴为外植体出愈率要高于子叶和贮藏根
[1,3,4]。
此外，杨宁等（1999）选取胡萝卜贮藏
根的皮层、木质部及韧皮部为外植体，发现从韧皮部诱导出的愈伤组织有较好的生长效果
[5]。
在胡萝卜愈伤组织诱导和分化中，基本培养基成分对胚性愈伤组织的诱导率和质量均有显著影响，一般认为MS 培养基对体细胞胚的发生更为有利。
但也有认为B5基础培养基略优于MS 基础培养基
[1]。
不同的激素种类、浓度及其组合对愈伤组织的诱导率有显著影响。
已有的研究结果表明，在培养基中加入2,4-D,6-BA,BA,KT 等，会影响胚性愈伤组织的发生。
2,4-D 的浓度从0.1～10.0 mg/L 不等，6-BA 的浓度从0.2～4.5mg/L 不等，BA 的浓度从0.5～1.0mg/L 不等，KT 的浓度从0.2～2.0mg/L 不等
[2,3,6]。
此外还
有研究结果表明，2,4-D/KT 比值是影响愈伤组织形成的关键因素，随着比值的增大，愈伤组织诱导率有逐渐升高的趋势[7]。
2、本论文课题的理论和实际应用意义：
胡萝卜（Daucus carrot），属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜植物。
由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。
中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。
近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。
我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。
但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多。
因此继续深入研究还是很有必要的。
此外，由于市面上的胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。
3、实验基本内容与方法：
（1）材料及设备：
6个培养皿、培养瓶、吸水纸、镊子、解剖刀、无菌操作台、胡萝卜直根（长度至少200mm,直径不小于40mm）、大约20% (体积比)浓度的次氯酸钙溶液1000ml、75%酒精、MS培养基、2,4-D、KT
（2）实验步骤：
A.培养基的配制:
①取无菌水200ml
②依次加入母液:大量元素25ml、微量元素2.5ml、铁盐2.5ml、有机元素
2.5ml、重复6次，在6个培养瓶中加入生长素2,4-D、KT（用量如下表）
实验号基本培养基2,4-D（mg/L）KT （mg/L）
1 MS 0 0
2 MS 0 0.5
3 MS 1 0
4 MS 1 0.5
5 MS 2 1.5
6 MS 4 2.5
诱导率=（形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数）×100%
③在个瓶中称取并加入琼脂2g，蔗糖7.5g
④放微波炉里融化
⑤每瓶定容500ml
⑥调PH(5.8~6.0)
⑦包扎后高温灭菌，待凝固后备用
B.外植体的清洗和消毒：用小刷在流动的自来水下洗刷胡萝卜,除去表面的屑粒。
用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。
先用75%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钙溶液消毒10min，放入无菌水中漂洗2～3次，用无菌吸水纸吸干待用。
C.接种：在无菌操作台上操作，把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm 左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm 、宽5mm 、高1mm 的小长块。
将凝固的培养基融化后适量倒入6个培养皿，用镊子将切好的胡萝卜外植体接种在固体培养基上，每个培养皿5块，按上表放入6个培养皿中，表上编号。
放于黑暗处25℃条件下进行暗培养。
D.培养：接种后的培养皿放在无菌箱里培养,培养期间定期更换培养基,避免营养不足影响效果。
并且要定期消毒,严格控制温度,定时光照,使实验免受无关变量影响。
注意观察记录外植体的变化，是否有污染或诱导出愈伤组织。
4、实验进程： 理论日程
约两周后，观察并计算胡萝卜的诱导率
期间作如下记录简表:
记录人: 温度: 湿度: 日光照时间:
实验事项
时 间 分离胡萝卜直根的新鲜外植体及接种进入培养基 第1天 愈伤组织的显著增殖
约14天
实验号 基本培养基
2,4-D
（mg/L ）
KT （mg/L ）
诱导率（%）
1 MS 0 0
2 MS 0 0.5
3 MS 1 0
4 MS 1 0.
5 5 MS 2 1.5
6 MS
4
2.5
记录项目日期培养物数目形态变化污染物数目所作处理
5、主要参考文献：
[1]张娅,曾君祉,周志勇,等.胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立[J].植物学通报,2005,22(增刊):7-42.
[2]郑回勇,郑金贵,等.胡萝卜再生体系及高效遗传转化体系的建立[J].广西农业科学,2002(5):237-241.
[3]尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红.胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究[J].山西师范大学学报，2004(2):72-76.
[4]高金秋,于丽杰.胡萝卜体细胞胚再生系统的建立[J].北方园艺,2009(8):73-77.
[5]杨宁,郭勇.胡萝卜细胞培养产生胡萝卜素的研究[J].广西植物,1999,19(1),84-88
[6]胡蓉.胡萝卜愈伤组织建立中的几个问题探讨[J].川北教育学院学报：自然科学版，1995(2):7,16.
[7]陈淑仪.诱导胡萝卜愈伤组织实验的探究.教学仪器与实验，2007:12-13.。