MPN多管发酵法测定氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌
1实验原理
最大可能数(或最大或然数法，most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数（具体参见《土壤与环境微生物研究法》，科学出版社，2009），适用于测定在一个混杂的微生物群落中但却具有特殊生理功能的微生物类群。
本方法是基于选择适当稀释倍数的悬液，接种在特定的液体培养基中培养，检查培养基中是否有该生理类群微生物的生长。
根据不同稀释度接种管的生长情况，用统计学方法求出该生理类群的微生物数量。
特点：利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
MPN法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
氨化作用是异养细菌将蛋白质水解为氨基酸，进而脱氨基产生氨的过程。
硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。
第一阶段由亚硝酸菌氧化氨为亚硝酸；第二阶段由硝酸菌氧化亚硝酸为硝酸。
这两类细菌都是自养的好氧细菌，生长缓慢，培养时间长。
反硝化作用是一类异养细菌在无氧条件下，利用有机物为电子供体，以硝酸盐为呼吸作用的电子受体，将其还原为N2O、N2的过程。
2实验材料
2.1样品
（1）固体样品（土样或沉积物等）：取一定质量的样品（1g或10g），装入盛有100ml无菌水的三角瓶中，置于摇床上振荡30min，制成均匀悬浊液。
然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。
（2）液体样品：取一定体积的样品（10ml），装入盛有90ml无菌水的三角瓶中，
充分混匀，制成10-1稀释样。
然后用10倍梯度稀释法稀释成一系列梯度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等，具体视样品而定，微生物丰富的样品稀释的梯度相应大一些）。
2.2培养基
（1）蛋白胨琼脂培养基（检测氨化细菌）：
蛋白胨5g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.2
（2）改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A（检测亚硝酸细菌）：(NH4)2SO4 2.0g，K2HPO4 0.75g， NaH2PO4 0.25g，MnSO4·4H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.03g，CaCO3 5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2
（3）改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基B（检测硝酸细菌）：NaNO2 1.0g，K2HPO4 0.75g，NaH2PO4 0.25g，MnSO4·4H2O 0.01g，
MgSO4·7H2O 0.03g，Na2CO3 1.0g，CaCO3 1.0g，蒸馏水 1000ml，pH 7.2 （4）反硝化细菌培养基（检测反硝化细菌）
KNO3 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO4 1.0g， KH2PO4 1.0g，柠檬酸钠
5.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2
将培养基配制好后装入试管中，每管装5ml，塞上硅胶塞（反硝化培养基的试管中应放入一倒置杜氏发酵管，以检测气体的生成），121℃灭菌30min。
每个样品需培养基12-30管（4-6个稀释倍数，每个稀释梯度3-5个平行）。
2.3检测试剂
（1）纳氏试剂：
甲液：称取20g碘化汞和10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
乙液：称取20g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中。
分别配制甲乙溶液，冷却后混合，放置2天后使用，保存于棕色瓶中，取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。
（2）格里斯试剂（Griess Reagent）I 和Ⅱ：
试剂I：将0.5 g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）加到150ml的20~30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
试剂Ⅱ：将0.5g α-萘胺（α-naphthylamine）加到50ml蒸馏水中，煮沸后，
缓慢加入150ml的20%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
（3）二苯胺试剂：
溶1.0g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水中，然后徐徐加入100ml浓硫酸（相对密度1.84）中，保存于棕色瓶中。
2.4器材
三角瓶、试管（10×100mm）及硅胶塞、滴管、白瓷比色板、酒精灯；
移液枪及吸头，洁净工作台、恒温培养箱等。
3 实验方法
取出灭菌分装好的各培养基试管，用无菌吸管接种样品的稀释液1ml，每个稀释度接种3-5管，接种4-6个稀释度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。
于25~30℃中恒温培养箱中培养。
3.1 氨化细菌测定
培养后第3天和5天检查培养基的浑浊度。
培养第7天，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加纳氏试剂两滴，检查是否出现棕褐色，确定是否产生氨。
3.2亚硝酸菌测定
培养10~14d后，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）溶液I 和Ⅱ各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。
记录下每个稀释度呈阳性反应的培养管数目。
3.3硝酸菌测定
培养10~14d后，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）溶液I 和Ⅱ各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。
此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。
记录下每个稀释度呈阳性反应的培养管数目。
3.4反硝化细菌的测定
培养14天后检查杜氏发酵罐中是否有气泡出现，培养液变浑浊。
用纳氏试剂检查是否有氨产生；格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ检测有无亚硝酸盐生成；用二苯胺试剂检测硝酸盐，判断反硝化作用进行情况。
4计算和报告计数结果
记录结果后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生
长的管数作为数量指标，从MPN数值表中求的数量指标后，再乘以数量指标第
一位数的稀释倍数，即为初始悬浮液中的菌液浓度。
若为固体样品，则换算成每
克样品中的细菌数量。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下：
稀释度l0-3 10-4 10-5 l0-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5 阳性管数 5 5 5 4 1 0 根据以上结果，在接种l0-3~10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种
l0-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，
而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查MPN
数值表最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍
数为100 000）。
那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。
即每毫
升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是
所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀
释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的
第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度l0-1 10-2 10-3 l0-4 10-5 10-6
重复数 4 4 4 4 4 4 阳性管数 4 4 3 2 1 0 以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查
表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。
按照重复次数的不同，
最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最
低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。
二是每
个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。
5 MPN数值表。