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• 白细胞介素:是一类具有激活、增殖、成熟和分化 •
机体免疫细胞，抗病毒、抗肿瘤及增强机体免疫 功能的细胞因子。 全球氨基酸的年产量估计在50~80万吨，其中 2/3用于食品，其余大部分作动物词料添加剂用， 还有相当数量用于医药工业和作为合成化学试剂 的前体。重组DNA技术已成功地应用于提高棒杆 菌和其他工业生产菌种的氨基酸生产。 全球的微生物多糖的产值估计已超过10亿美元。 这类生物高分子属于胶体，其独特功能在于它们 可作为增稠剂、亲水胶体，用于水基系统中的乳 化、悬浮和稳定混合物。它们在温度、pH和盐浓 度大幅度变化的条件下仍能与其他系统相容，甚 至起协同增效作用。
2.提取质粒
从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的 提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、 PCR扩增、银染序列分析。 2.煮沸裂解法：指用煮沸加热的方法裂解菌 体,以提取质粒。
3.基因重组
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内 切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的 基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰 岛素的DNA质粒。
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5.3泡沫对发酵的影响及其控制
• 5.3.1泡沫的产生及其影响 • 发酵过程中因通气搅拌与发酵产生的二氧化碳以
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及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物 质的存在，使发酵液含有一定数量的泡沫。 泡沫的存在可以增加气液接触表面，有利于氧的 传递。但也给发酵带来许多负作用，主要表现在: ①降低了发酵罐的装料系数。②增加了菌群的非 均一性。③增加了污染杂菌的机会。④大量起泡， 控制不及时，会引起产物的流失。③消泡剂的加 入有时会影响发酵或给提炼工序惹来麻烦。
• 5.3.3泡沫的控制 • 泡沫的控制方法可分为机械消沫和消泡剂
两大类。 • 机械消沫：是指借机械引力引起的剧烈振 动或压力变化而起到的消沫作用。 • 消泡剂消沫：发酵工业常用的消泡剂分为 天然油脂类、聚醚类、高级醇类和硅树脂 类。常用的天然油脂有玉米油、豆油、米 糠油、棉籽油、鱼油和猪油等，除作消泡 剂外，还可作为碳源。
生产方法
• 胰岛素的生产方法主要有两种，一种是从
动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪 胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提 取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只 能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛 素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、 纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手 段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、 疗效好.
5.发酵过程控制与优化
• 狭义的发酵是指在厌氧条件下葡萄糖通过
酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过 程。 • 广义则将发酵看做是微生物把一些原料养 分在合适的发酵条件下经特定的代谢途径 转变成所需产物的过程。
5.1发酵过程技术原理
• 微生物发酵受诸多因素影响，各种因素相
互制约，故必须掌握发酵代谢规律，微生 物与其周围环境的相互作用和运用分子生 物学的原理来操纵代谢物流。 • 微生物发酚过程可分为分批、补料-分批、 半连续和连续等几种方式。
5.5发酵染菌的防治及处理
• 5.5.1染菌的途径分析 • 染菌的途径不外有以下儿方面:种子包括进罐前菌种室阶 • • •
段出问题;培养基的配制和灭菌不彻底;设备上特别是空气 除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。 5.5.2染菌的判断和防治 杂菌的发现，常用镜检或无菌试验方法，这是确认染菌的 依据。从一些状态参数，如DO变化的规律也可作为染菌 预报的根据。 遇到早期染菌，原则上可适当改变生长参数，使有利于生 产菌而不利于杂菌的生长，如降低发酵温度等。加人某些 抑制杂菌的化合物也不失为一种急办法，条件是这种化合 物对生产菌无害对生产影响不大和在下游精制阶段能被完 全去除。中后期染菌除非是噬菌体，通常后果不会那么严 重，这时发酵液中己产生一定浓度的抗生素，对杂菌已有 一定抑制作用。实际生产中常采用大接种量的原因之一是 即使不慎污染了极少量杂菌，生产菌也能很快占优势。
• 5 .4 .2自溶的监测 • 发酵后期密切监视菌的自溶情况对稳产和
提高下游工段的产物回收率有重要意义。 • 通常把微生物因养分的缺乏或处在不利的 生长环境下受其自身的作用开始裂解的过 程称为自溶。 • 研究酵母的自溶的基本过程与内部结构的 变化证实了蛋白质水解是自溶的基本动力。 而细胞壁的降解是次要的。造成自溶的外 源因素有:化学物质，如高浓度乙醇、碳氮 源或氧的缺乏。
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• 胰岛素：在1982年由大肠杆菌生产的胰岛素成为
第一个获执照的重组体衍生的人用生物制品。胰 岛素是用来治疗I型糖尿病患者。这种病人的胰岛 自己不能生成足够的胰岛素，需依赖外源供给。 生长激素：儿童的生长和体重的增加要靠其生长 激素，这是一种垂体产物。 促红细胞生成素：是一种为响应低氧而由肾脏产 生的激素，它在骨髓中负责促进红血球细胞的生 长和分化。 亲甲醇酵母：毕赤酵母是生产外源蛋白的最佳寄 主之一，因它具有很强的受甲醇诱导的AOXI启 动子。
• 5.3.2发酵过程中泡沫的消长规律 • 发酵过程中泡沫的多寡与通气搅拌的剧烈
程度和培养基的成分有关。玉米浆、蛋白 陈、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、糖蜜 等是发泡的主要因素。其起泡能力随品种、 产地、加工、贮藏条件而有所不同，还与 配比有关。此外，培养基的灭菌方法、灭 菌温度和时间也会改变培养基的性质，从 而影响培养基的起泡能力。
5.6基因工程菌培养与表达
• 蛋白在生物医学科学上的应用分4个方面:即疾病
或感染的预防;临床疾病的治疗;抗体存在的诊断 和新疗法的发现。这方面研究的重点着眼于应用 克隆基囚来生产一些称之为生物制品的蛋白，如 疫苗、诊断工具和激素等。 利用重组DNA技术来生产蛋白有4方面的理由:① 品种的需求②数量上的满足③安全④具有特异性
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胰岛素的生产
简介
• 胰岛素(Insulin)是糖尿病， 尤其是I型糖尿病的
特效药物，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低 血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相 关资料表明：糖尿病已成为继心血管疾病、肿瘤 之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康， 全球共有糖尿病患者 1.75 亿人，中国糖尿病患 者 9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。 2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销 售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛 素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药 物的开发和生产具有重大的社会效益和经济效益。
通过基因工程手段生产人胰岛素的 步骤
1.提取目的基因 2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生
1.提取目的基因
即从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限 制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。 1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附 近基因进行剪切，再提取所需要的。至于 如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导 出基因序。 4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段， 用于商业化运作。
• 分批发酵：是一种准
封闭式系统，种子接 种到培养基后除了气 体流通外发酵液始终 留在生物反应器内。 补料-分批发酵：是在 分批发酵过程中补入 新鲜料液，以克服由 于养分的不足，导致 发酵过早结束。
• 半连续发酵：在补料分批发酵的基础上加 上间歇放掉部分发酵 液便可称为半连续发 酵。 连续发酵： 是指发酵 过程中一面补入新鲜 的料液，一面以相同 的流速放料，维持发 酵液原来的体积。
5.4.发酵终点的判断与自溶的监测
• 5.4.1发酵终点的判断 • 发酵类型的不同，要求达到的目标也不同，因而 • •
对发酵终点的判断标准也应有所不同。 判断放罐的指标主要有产物浓度、过滤速度、菌 丝形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的粘度和外 观等。 对抗生素发酵，老品种抗生素发酵放罐时间一般 都按作业计划进行。但在发酵异常情况下，放罐 时间就需当机立断，以免倒罐。新品种发酵更需 探索合理的放罐时间。
4.将质粒送回大肠杆菌
在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收. 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞 壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进 入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法 诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的 生理状态）。
• 人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。
是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有 相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进 肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和 利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉 和肝脏内，并抑制糖原异生。
生产企业
• 丹麦诺和诺德、美国礼来、中国通化东宝、深圳
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科兴、徐州万邦。 美国的礼来和丹麦的诺和诺德是目前向市场供应 基因工程胰岛素的主要厂家，他们分别研究和利 用大肠杆菌和酵母生产人胰岛素。这两个系统各 有利弊，一般讲，大肠杆菌系统表达效率高，但 后处理较难 。 酵母系统表达量虽然比较低，但 表达转录与翻译后, 便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大 量繁衍,便可大量生产出胰岛素。 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核 生物没有内质网、高尔基体等，不能进行 多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体 外加工。
医用的胰岛素
• 医用的胰岛素主要有两种，一种是从动物
脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪胰岛 素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产 量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提 取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要 从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯 度低，疗效差；一种是通过基因工程手段 的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、 疗效好
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5.2发酵条件的影响及其控制
• 常规的发酵条件有:罐温、搅拌转速、搅拌功率、 •
空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体， 通氨速率以及补水等。 能表征过程性质的状态参数有:pH 、溶氧、溶解 二氧化碳、氧化还原电位、尾气中的氧和二氧化 碳含量、基质或产物浓度、代谢中间体或前体浓 度、菌浓等。 培养基对养分的需求：碳源、氮源、矿物盐、特 殊养分、复合培养基。