3，5-二硝基水杨酸比色法测量还原糖含量
一．实验目的
1、掌握用制作标准曲线的方法来测量还原糖的含量.
2、学会使用721精密型分光光度计。

3、熟练容量瓶、移液管等简单仪器的使用方法。

二．原理
1、还原糖是指含有醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，多糖中有乳糖和麦芽糖等是还原糖，而淀粉和蔗糖是非还原糖。

DNS即3，5-二硝基水杨酸中含有的硝基使其有较强的氧化性，与醛基在加热的条件下发生氧化还原反应，生成红色物质3-氨基-5硝基水杨酸。

反应方程式如下：
2、不同浓度的还原糖液与DNS反应时，生成的3-氨基-5硝基水杨酸的浓度不同，导致反应后液体颜色深浅不同。

在分光光度计下测量标准梯度浓度的葡萄糖溶液与DNS反应后液体的OD540（波长为540nm条件下样液的光密度值），做出OD540——还原糖含量标准曲线，对于未知样品的测量，只需将OD540带入图像，找到相应的还原糖含量值即可。

3、本实验总糖的测量步骤中，因为样品（面粉）主要由淀粉构成不能与DNS直接反应，所以需要用酸水解法将淀粉降解为单糖进行测量。

淀粉由单糖缩合产生，在降解过程中会引
入水分子，所以计算总糖的质量时，应除去水的质量。

M葡萄糖=180，M水=18，由于淀粉的
=0.9倍。

碳链极长，忽略链末端本身含有的一个水分子，则淀粉的质量为还原糖质量的180−18
180
三．试剂（配制方法）
提前配制试剂
DNS（3,5-二硝基水杨酸试剂）：6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH加到热酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶液溶于500蒸馏水中），再加5g重结晶酚和
5g亚硫酸氢钠于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000ml，储存于棕色瓶中。

碘化钾—碘试剂：称取5g碘10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

酚酞试剂：0.1g酚酞溶于250ml 85%的乙醇中，棕色瓶储存。

6mol/L HCl 溶液
10% NaOH 溶液
面粉样品
0.5mg/mL葡萄糖溶液：精确称取105℃烘至恒重的葡萄糖0.5g，用水定容到1000ml。

四. 实验仪器
（一）每组配置
试管：10ml*10 试管架：1
试管夹：2 铁架台：1
移液管：1ml*2 5ml*2 10ml*1 移液管架：1
胶头滴管：2 培养皿：1
容量瓶：100ml*3 漏斗: 1
烧杯: 100ml*3 500ml*1
（二）公用仪器
分光光度计：3 比色皿：3*4
水浴锅：6 蒸馏水：瓶*3
滤纸：若干称量纸：若干
废液缸：1L烧杯*3
五．操作步骤
（一）标准梯度糖液配制
分别取0.5mg/ml的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于1~6号试管中，并用蒸馏水补足到1ml。

（二）还原糖液的提取
1、精确称取面粉1.0g于100ml小烧杯中，少量水调成糊状后，再加入50ml蒸馏
水搅匀。

2、水浴50℃保温20min后，用水定容到100ml。

3、过滤，取滤液1ml于7、8号试管中，待用。

（三）总糖的水解与提取
1、称取面粉1.0g，放入100ml小烧杯中。

2、加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml蒸馏水，沸水浴加热25min.
3、用胶头滴管滴2~3滴碘化钾—碘溶液于培养皿中（可以稍微稀释），用细玻璃棒
蘸少量样品与之进行反应，若无深蓝色物质产生说明总糖已经水解完全，否则继续
沸水浴加热并每隔5min以相同的方法再次测定，直至完全水解。

4、取出完全水解的样品，冷却后滴加2~3滴酚酞，用10% NaOH滴定至中性。

5、用水定容到100ml，过滤，取5ml滤液，再次定容到100ml。

6、取5中第二次定容的液体1ml于9、10号试管中，待用。

（四）OD540的测量及标准曲线的制作
1、在10支试管中加入0.5ml DNS试剂，混匀，十只试管放入500ml装有少量水的
烧杯中，进行沸水浴加热5min，再流水冷却。

2、每支试管加入再4.0ml蒸馏水并摇匀。

3、取液体装入比色皿中，每个样品测三次，取其平均值为其OD540，以未加葡萄糖
的试管即1号试管内的液体作为参比液。

4、取1~6号试管中的数据，做出OD540~还原糖含量曲线，纵坐标为OD540，横坐
标为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，单位mg。

5、在曲线上读出7~10号试管的含量值。

（五）计算含量
1、取7，8号试管含量的平均值作为还原糖含量值，取9，10号试管含量的平均值
作为总糖的含量值。

2、
还原糖含量%=还原糖毫克数×样品稀释倍数（100）
样品毫克数（1000）
×100%
总糖含量%=水解后还原糖毫克数×样品稀释倍数（2000）×0.9
样品毫克数（1000）
×100%
六．实验注意
1、标准曲线的制作建议用EXCEl制作，也可以只用坐标纸，用最小二乘法得出公式，
需附图在每个组员的实验报告上。

2、本实验中用水浴锅进行操作，沸水浴操作时，只需将温度控制在90~93℃即可，温
度过高（超过95℃）会使还原糖煮糊。

3、OD540在测量时，每一个比色皿都需要测量三次（包括标准糖液、还原糖液和总糖液），
取平均值。

测量时，打开盖子再重新盖上盖子读出OD540即为一次测量，同一个比色皿再测量时不要拉动伸缩杆。

4、标准曲线制作过程中如有明显偏离直线的一个点，应果断舍去，如果有两个或者两
个以上的时候，全部10支试管的糖液重新制作。

这是为了使所有的糖液在相同的条件下加热，避免无关因素引起的误差。

5、10% NaOH滴定时，滴定终点应为滴加半滴NaOH溶液刚刚变为粉红色，且静置30s
不褪色。

若多滴则重新加入盐酸进行滴定，若少滴，则用半滴法进行滴定。

附实验数据记录。