活性：5’-P去磷酸
(2)磷酸酶作用机理
催化核酸分子脱掉5‘－P，使DNA分子5’－P转化成5‘－OH－－－脱磷酸作用。
这样产生的5‘－OH末端，为随后在[r-P]ATP和T4多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。
5、反转录酶等。
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
DNA聚合酶Ⅰ特点
活性：5’3’聚合低
5’3’外切有
3’5’外切低
DNA聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记
(1)DNA聚合酶Ⅰ的两种特殊反应：
切口转移与链取代
(2)切口转移法制备放射性DNA分子杂交探针
二、Klenow片段
1、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段
活性：
5’3’聚合低
5’3’外切无！
3’5’外切低
2.Klenow片段的应用
末端补平
末端标记及随机引物标 DNA聚合酶
1. T4 DNA聚合酶特点
活性：
5’3’聚合低
5’3’外切无
3’5’外切高！
2.T4 DNA聚合酶活性的条件
模版、引物、原料dNTP
c:获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。
缺点：
当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。
需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。
4.平末端连接
---衔接物连接法与接头连接法
(1)平末端的衔接物连接法
衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。
解决方法：化平末端为粘性末端
3.平末端连接---同聚物加尾法
（1）末端脱氧核苷酸转移酶
功能：5’至3’单链聚合
作用特点：单链；无模版
作用机理：
a:用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸,获得3’-OH的单链延伸末端。
b:加入dATP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。
活性：
5’3’聚合更高(*3)！
5’3’外切无
3’5’外切无！
修饰的T7 DNA聚合酶的应用：
合成能力：更高、更快、更强！
标记：重在“掺”与
末端补平：
二.激酶(kinase) &磷酸酶(phosphotase)
T4多核苷酸激酶
(1)特点
来源：T4噬菌体pseT基因编码；
活性：5’-OH加磷酸；
(2)T4 kinase5’末端标记的机理
3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。
4、AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。
5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。
Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口”
四.两种DNA连接酶
1. E. Coli DNA ligase
当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。
结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。
第五节DNA聚合酶DNA Polymerase
常用的DNA聚合酶：
1、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ
2、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片段酶
3、T4 DNA聚合酶
4、T7 DNA聚合酶
成功秘诀：好市口＋个性经营第二章Enzymes
第四节DNA连接酶Ligase
一、DNA连接酶的发现
二.连接条件
必须是两条双链DNA。
Байду номын сангаасDNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。
三、连接反应的机理
1、ATP（NAD+)提供激活的AMP。
2、ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。
来源：E.coli
适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端）
2. T4 ligase
来源：T4 phage
适用：粘性末端及平末端
T4 vs. E.coli
T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！
五.Ligase的反应温度
最佳温度：
界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。
连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR）
寡核苷酸连接测定法的作用
检测突变
寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。
1.寡核苷酸连接测定法
（1）原理:
两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。
(2)平末端的接头连接法
将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。
七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌
热稳定的DNA连接酶的应用：
寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA）
六.DNA分子连接的四种形式
1.粘性末端；2.平末端；3.平末端加尾；4.平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor)
(1)Digestion and Ligation
1．粘性末端连接
Problem: (自我环化作用)
解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸
2.平末端连接
粘性末端连接效率高于平末端约100倍！
3. T4 DNA聚合酶的“取代合成”法末端标记
四.T7 DNA聚合酶
1. T7 DNA聚合酶特点
活性：
5’3’聚合高！
5’3’外切无
3’5’外切高
2. T7 DNA聚合酶的应用
合成：高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响
标记：类似T4（取代合成）
末端补平：类似T4
第六节核酸修饰酶
一.修饰的T7 DNA聚合酶
用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5‘OH基国暴露，同多核苷酸激酶从r-P ATP分子中转移来的r-P基团键合，实现末端标记。
(3) T4多核苷酸激酶的应用
a:5’末端标记
b:5’末端磷酸化
磷酸酶
(1)特点
来源：细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphotase，BAP)，E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（Calf intestinal Alkaline Phosphotase, CIAP)，小牛肠。