现代生物学实验技术实验报告
实验一、超薄切片
一、实验目的
学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。
二、实验材料
植物幼嫩叶片、小鼠肝脏细胞
三、实验试剂
2.5％戊二醛、PBS、1％锇酸、30％丙酮、100％丙酮、
Epon812包埋液、蜡油
四、实验器材
离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机、
五、实验步骤
1、取材固定：从植株上取叶片或者取小鼠肝脏细胞，切取
1mm3左右大小的组织块，立即放入PBS（pH7.2)配制
的2.5%戊二醛中固定1小时。
2、用0.1molPBS缓冲液冲洗三次每次3～5分钟。
3、1％锇酸固定1小时，然后用缓冲液冲洗三次每次3～5
分钟。
4、丙酮脱水：30％－50％－70％－80％－90％－100％－
100％每级5～10分钟
5、浸透：脱水剂：包埋剂=3：1 1小时
脱水剂：包埋剂=1：3 过夜
6、聚合：45 ℃12h 60 ℃24h
磷酸缓冲液0.2molL-1 PBS 配制
A液：Na2HPO4 .2H2O 35.61g
加DDW 至1000ml
B液：NaH2PO4 .H2O 27.6g
加DDW 至1000ml
不同pH磷酸缓冲液的配制
pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6
A液(ml)
18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 B液(ml)
31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5
Epon812包埋液的配制
Epon812树脂20ml
DDSA 4.6ml
MNA 15.3ml
DMP-30 0.8ml
2、支持膜的制备
将一个干净的载玻片垂直放入含有0.3~0.5%氯仿配制的聚乙烯醇缩甲醛制模剂中，放置两三秒后将载玻片垂直取出。
用刀片在含有膜的载玻片上划出所需要的正方形，然后将载玻片45度倾斜放入水溶液中，使膜飘在水面上，选取厚薄合适的膜，将膜放在载网上，以备后面用。
3、切片
首先制刀，将玻璃片制成梯形的刀片，以备切片时使用。
将包埋块置于显微镜下进行修整，将其修为最上端为正方体。
在切片机上进行切片操作，使切下来的样品片漂浮在水槽中。
对切下来的样品块进行染色并观察。
六、注意事项
1、取材的时候动作要迅速，组织离体后应将其快速放入
固定液中。
并且要尽量减少损伤，减少牵拉或挤压组
织。
组织块的大小一般为1mm3。
2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真
空的方法让样品沉入溶液中。
3、饿酸为剧毒、极易挥发的试剂，使用时要注意安全。
4、脱水时要逐级脱水，而不能急剧脱水，更换液体时动
作要快，不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产
生气泡。
5、在制备支持膜的时候手一定要稳，不能抖动，这样制
出的膜才会厚薄均一。
在将载玻片浸水的时候要缓慢
入水，这样才会使膜利用水的张力慢慢的离开载玻
片，漂浮在水面上。
实验二、投射和扫描电镜
一、实验目的
1、掌握透射电子显微镜的成像基本原理及其应用
2、掌握扫描电子显微镜的成像基本原理及其应用
二、实验原理
1、透射电子显微镜的成像基本原理
在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。
2、扫描电子显微镜的成像基本原理
利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。
电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成像。
三、主要电镜制样技术
1、超薄切片技术
用于电镜观察的样本制备
2、负染色技术
染色背景，衬托出样品的精细结构
3、冰冻蚀刻技术
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。
4、电镜三维重构技术
电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。
电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。
实验三、胶体金的制备
一、实验原理
氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。
由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体
金颗粒表面的包被过程。
吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。
用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
二、实验步骤
•柠檬酸三钠法
0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加热至沸腾，加4ml
1%柠檬酸三钠水溶液，出现酒红色。
•金颗粒大小与柠檬酸三钠的关系
柠檬酸三钠（ml) 4 1.5 1.0 0.75 金颗粒的直径（nm) 15 30 50 60 胶体金与标记蛋白的配比
•胶体金pH的调节：用0.1mol K2CO3调到pH9.0
•取7支2ml离心管分别加入1ml胶体金
•再向每支管中加入1ml不同浓度的牛血清白蛋白
•混合均匀后分别加入0.1ml10%NaCl
•混合均匀后按照下图观察颜色的变化
•确定出包裹胶体金蛋白的量
胶体金与标记蛋白的比例
40 35 30 25 20 15 10
蛋白含量μg（牛血清白蛋白）
三、注意事项
1、配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。
2、氯金酸的质量要求上乘，杂质少。
最好是进口的。
3、玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻
璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，
再用双馏水冲洗后使用。
否则影响生物大分子与金
颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期
大小的金颗粒。