壳聚糖固定化酶研究进展夏文水1，2谭丽2（1.武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北武汉430023；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）(1．College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan，Hubei430023,China；2.School of Biotechnology,Jiannan University,Wuxi,Jiangsu214122,China)摘要：介绍壳聚糖作为固定化酶载体的主要3种情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体。
壳聚糖及其衍生物的固定化酶具有酶活性高、回收率高和耐贮藏等特点。
指出壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。
关键词：壳聚糖；衍生物；固定化酶；Abstract:Chitosan and its derivatives with superior functionality and biocompatibility,were used to immobilized enzymes by method of adsorption\adsorb-cross linkage\gel-embed and complex carries,there are three kinds of enzyme carrier included chitosan,chitosan derivative and mixture of chitosan with other compounds.The immobilized enzymes prepared with chitosan and its derivatives exhibited high activity,high recoverity and long storage time.The technology of immobilized-chitosan enzyme offers an extraordinary potential in applications for food and other fields.Keywords:Chitosan；Derivatives；Immobilized enzyme——————————基金项目：湖北省教育厅科学研究计划项目（项目编号：D200518008）作者简介：夏文水（1958-），男，武汉工业学院食品科学与工程学院教授。
E-mail:Xiaws@收稿日期：2007-10-02壳聚糖（chitosan）是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是由大部分2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元和少量N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖单元以β-1，4糖苷键连接的二元线性共聚物，相对分子质量通常在几十万到上百万左右，其结构式如图1所示。
壳聚糖除有多糖结构外还含有氨基功能基团，具有优越的功能性和生理保健作用[1]，是一种资源量丰富、性质独特、多功能的天然高分子生物材料。
它具有良好的生物相容性，可被生物降解，无毒无害安全，对环境无污染；具有很好的成胶性质，易于加工成粉、膜、多孔微球、凝胶、纳米粒子等多种形态，是一类性能优良的固定化酶载体。
近年来有关壳聚糖及其衍生物应用于固定化酶方面的研究报道数量很多，已经用于100多种酶的固定化[2]。
壳聚糖作为固定化酶载体主要分为以下3种情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体，下面将分别加以介绍。
图1-壳聚糖的结构1壳聚糖直接作为固定化酶载体壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料，耐热性好，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。
John等[3]将壳聚糖研磨成粉状，与粉状胰蛋白酶混合研磨，通过吸附作用固定胰蛋白酶。
结果表明：研磨时间越长，固定化效果越好。
李志国等[4]以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，结果表明：固定化酶的可操作性优于游离酶。
以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶，酶不易失活，但酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落，因此，多数情况下使用吸附-交联法以提高其稳定性。
最常用的交联剂是甲醛和戊二醛[5,6]。
周纪宁[7]采用甲醛活化交联壳聚糖固定L-天冬酰胺酶，其活力回收可达20%～25%。
但更多交联剂采用戊二醛。
岳振峰等[8]将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体，采用吸附—交联的方法进行固定化。
在最佳固定化条件下，酶活力回收率为78.1%，具有较好的强度。
吴茜茜等[9]研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化的影响。
蔡俊等[10]对谷胱甘肽硫转移酶的固定化、游离酶和固定化酶的酶学特性进行了研究，通过试验确定谷胱甘肽硫转移酶的最佳固定化条件为先用2%壳聚糖吸附酶，然后再加戊二醛交联，戊二醛浓度1.2%，交联时间为16h。
王俊等[11]以壳聚糖为载体，采用戊二醛为交联剂的方法来固定海藻糖合成酶。
赵江等[12]采用壳聚糖吸附和戊二醛交联的方法，将胃蛋白酶固定于壳聚糖上。
戊二醛交联是双功能团醛基与壳聚糖和酶分子中的氨基发生亲核加成反应生成西佛碱(Schiff base)，通过共价键结合。
其键合机理如下：壳聚糖的氨基+OHC(CH2)3CHO+酶的氨基→壳聚糖—N=CH(CH2)3CH=N—酶采用戊二醛为交联剂，酶能够通过化学键与载体结合，并且其操作稳定性较吸附法和包埋法有所提高，因而在研究中受到广泛重视。
此方法已经用于多种酶的固定，如表1所示。
表1采用戊二醛交联活化的壳聚糖作为载体的固定化酶酶载体形态参考文献时间青霉素酰化酶AS1.398中性蛋白酶纤维素酶脲酶三角酵母D-氨基酸氧化酶链霉菌Strz-2胞外木聚糖酶木瓜蛋白酶葡萄糖氧化酶真菌漆酶碱性脂肪酶谷胱甘肽硫转移酶α-葡萄糖转苷酶α-淀粉酶β-淀粉酶切枝普鲁兰酶单宁酶颗粒中空球形中空球形粉末状凝胶微球无定形粉末状微球膜凝胶凝胶粉末状中空球形粉末状[13][14][15][16][17][18][19][20][21][22][23][24][25][26][27]2004200020012004200320052003200420012002200320032004200520032壳聚糖衍生物作为固定化酶载体壳聚糖只能酸溶或溶于酸性水溶液中，不能溶于有机溶剂；为了改善它的物理和化学特性可对壳聚糖进行化学修饰，如酰基化、羧基化、醚化、Schiff反应、N-烷基化、酯化、氧化、卤化、接枝共聚、络合等反应，生成一系列具有不同性能的衍生物[28]，可用作固定化酶的载体。
壳聚糖在甲醇/乙酸介质中与过量醛进行Schiff碱反应，可生成醛亚胺化衍生物。
魏荣卿等[29]以壳聚糖为载体，与双醛淀粉反应形成酶柔性固定化模型(Chitosan-DAS50)，对木瓜蛋白酶进行柔性固定化。
在酶用量为14.4mg/g(酶/干球)、pH8的条件下，固定木瓜蛋白酶18h，所得的固定化酶活力回收率达72%，相当于采用壳聚糖-戊二醛(Chitosan,GA)载体的3倍。
雷福厚等[30]将壳聚糖制备成壳聚糖铜高分子络合物，以配位键的形式对多酚氧化酶进行固定化,，过程为：壳聚糖上的—NH可以与Cu2+形成高分子络合物，由于高分子键的刚性作用，此络合物的2Cu2+配位未饱和，可以进一步与酶中的游离氨基配位，使酶以配位键的形式固定在壳聚糖上，此方法称为高分子配位键法。
这种方法制备简单，固定化酶过程中酶损失少。
壳聚糖铜固定化多酚氧化酶在最佳pH值、热稳定性、底物对酶的抑制及米氏常数等方面均表现出酶催化特征。
说明以功能高分子化合物为载体，以Cu2+为配位中心，通过配位桥键的形式将酶固定在高聚物上(即高分子配位键法)是可行的。
络合、甲醛改性、表氯醇（3—氯—1,2—环氧宋扬等[31]以壳聚糖微珠为载体，以CuSO4丙烷）和氨水修饰，戊二醛活化，偶联牛胰蛋白酶配基，制成抑肽酶亲和吸附剂—化学改性与修饰微球壳聚糖固定化胰蛋白酶，方法过程简单，样品酶比活为5700KIU/mg，质量稳定，成本较低；该吸附剂机械强度高，抗污染能力较强，非特异性吸附较小，可以反复使用，价格低廉，适合工业化生产。
由于微球壳聚糖载体分子上存在大量游离氨基，化学性质极其活泼，表现有pH缓冲作用，且能与酶催化产物醌反应。
为解决上述问题，肖厚荣等[32]先用Cu2+与壳聚糖上的部分氨基络合，将其保护起来，然后在弱碱性条件下使微球壳聚糖与中性甲醛反应，未络合的游离氨基及乙酰氨基转变成化学性质不活泼的一羟基或二羟基氨基。
载体经化学修饰，增加反应基团数，从而提高吸附容量和固定化酶单位活力。
比较试验表明：经修饰后壳聚糖偶联多酚氧化酶比对照高2.3倍。
刘峥等[33]以过硫酸钾/亚硫酸氢钠为引发体系制备了丙烯腈接枝壳聚糖的共聚物并以其为载体固定化α-淀粉酶探讨了固定化酶的最佳制备条件和固定化酶的性质并与游离酶壳聚糖作为载体的固定化α-淀粉酶进行了比较，结果表明：丙烯腈接枝壳聚糖共聚物是固定化α-淀粉酶的优良载体。
袁春桃等[34]也以接枝共聚物壳聚糖-g-丙烯腈作为载体固定化木瓜蛋白酶，试验表明：壳聚糖-g-丙烯腈可以较好地吸附、包结木瓜蛋白酶，固定化酶的酶活力较高，且稳定性得到提高。
方波等[35]以壳聚糖为原料，采用反相悬浮交联的方法制取微球型壳聚糖颗粒，再进行羟丙基氯化及胺基化，制备了一系列新型壳聚糖胺基衍生物微球。
在壳聚糖微球的分子结构中分别引入了羟丙基和不同种类的胺基，使其结构中胺基的含量上升，碱性增强，成为新型壳聚糖胺基衍生物微球；并初步考察其吸附牛血清白蛋白(BSA)性能。
方波等[36]还研制了新型壳聚糖胺基衍生物—乙二胺羟丙基壳聚糖(EDA-HPCS)，并将其用于固定天门冬酰胺酶。
Zhang、Gong等[37]用聚乙二醇（PEG）修饰壳聚糖膜，结果表明：PEG可改善壳聚糖的性能而不破坏壳聚糖良好的生物相容性。
霍红光等[38,39]研究了聚乙二醇改性壳聚糖(PEG-CS)固定化L-天门冬酰胺酶催化缓冲液中天冬酰胺的反应过程，结果表明：在适当的反应条件下，聚乙二醇改性壳聚糖固定化L-天门冬酰胺酶可以很好地水解缓冲液中的天冬酰胺。
有报道[40,41]用一种新型的交联剂—三羟甲基磷(THP)与壳聚糖胺基发生Mannich反应生成壳聚糖-THP，接着壳聚糖-THP与α-葡萄糖苷酶的胺基再一次发生Mannich反应完成固定化。