有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝 基四唑
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
10
免疫组织化学结果分析
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
11
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
➢一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。
3
二 抗
IHC
一
反
抗
应 原
抗
理
原
示
意
图
辣根过氧化物酶（HRP）
棕褐色络合物
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
细 胞
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
4
组织切片/芯片制作
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
5
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
➢组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及 DAN分子，是一种高通量的研究分析工具。 研究者一次可有效利用成百上千份正常或疾 病状态下的组织标本来研究特定基因及其所 表达的蛋白质与疾病之间的关系。
2. AEC显色法
➢产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生 溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中 复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物 酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 ➢试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）
免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析
➢ 免疫组化（IHC）的应用介绍 ➢ 免疫荧光（IF）的应用介绍 ➢ 流式细胞术（FC）的应用介绍 ➢ IHC、IF、FC区别与联系
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2
免疫组织化学 （Immunohistochemistry, IHC）
➢特点：该法孵育时间短（通常为10min）， 灵敏度高以及低背景染色等特点。
3. Polymer酶标二抗法
➢原理：该法采用一段多聚氨基酸聚合物做 为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可 再标记上多个HRP/AP酶分子，所以同样具 有很高的信号放大作用。
➢特点：灵敏度高；操作步骤简单；无需进 行内源性的生物素封闭。
9
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
➢产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 ➢试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
3. BCIP/NBT显色法
➢产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色 物质。 ➢试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四 唑
免疫组织化学原理及特点 ➢利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。
➢免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 ➢免疫组化染色（IHC）； ➢原位杂交（ISH）； ➢荧光原位杂交（FISH）； ➢原位末端标记分析（TUNEL）； ➢原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
2. SP法
➢原理：根据生物素(Biotin) 与链霉亲和素 (Streptavidin)具有强结合力的原理设计。在 一抗（兔源与鼠源）与相应的靶抗原结合后， 生物素化标记的抗多价二抗与一抗特异结合； 二抗上标记的生物素与标记了辣根过氧化物 酶（HRP）的链霉亲和素结合，形成抗原～ 特异性一抗～生物素化的二抗～HRP 标记 的链霉亲和素复合物。
4. BCIP/INT显色法
➢产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、 western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。
➢ 试剂盒组成：
➢全套鼠类器官组织切片；
➢全套猴类器官组织切片；
➢人类常见癌症组织切片；
➢组织芯片客户定制服务。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
6
Hale Waihona Puke 疫组化流程示意图免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
7
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
➢原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 ➢特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
4. 直接酶标二抗法
➢该法是将HRP/AP酶分子直接标记于二抗 上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实 验简单，成本低，但是因为没有信号放大作 用，所以对很多表达丰度不是很高的抗原就 可能检测不到。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析
8
IHC常用酶标二抗原理示意图
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应 用比较及常见问题分析