安徽理工大学医学院
School of Medicine
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第 次课
授课时间 年 月 日
课程名称 免疫学检验 年 级
教师
张荣波
专业技术 职务
教案完成时间： 年 月 日
专业、层次
医学检验（本科）
授课方式 （大、小）
大 学时 4
授课题目（章、节）
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特 征。当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有 两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞
基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括 B 淋巴细胞杂 交细胞和 T 淋巴细胞杂交细胞。
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辅助手段和时间 分配备注
基本内容
第三节 基因工程抗体技术 随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基因 工程抗体改造现有优良的鼠单克隆抗体的基因，尽量减少抗体中的鼠源成 分，保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体．基因工程抗体。 一、人源化抗体 人源化抗体以基因克隆及 DNA 重组技术改造将鼠源性单克隆抗体使其 大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既保留了亲本鼠克隆抗体的亲合力 和特异性，又降低了鼠单克隆抗体的异源性。 (一)人一鼠嵌合抗体 人一鼠嵌合抗体是通过基因工程技术将人 IgC 区与鼠 IgV 区连接，导 入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体。人一鼠嵌合抗体的特异性及亲合 力与亲本鼠单克隆抗体等同，但在人体内的半衰期可明显延长。 (二)抗体的表面修饰 通过改变 Ig 可变区表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性。将 亲本鼠单克隆抗体 Fv 段表面暴露的骨架区中与人不同者改为人源性，使 Fv 的表面人源化，消除其免疫原而不影响 Fv 的整体空间构象。 二、小分子抗体 将抗体分子的抗原结合部位组建成分子量较小，但具有抗原结合功能 的分子片段，称为小分子抗蠢小分子抗体具有以下特点：可在大肠杆菌等 原核细胞表达生产成本降低；易于穿透血管或组织到脚胞部位，有利于疾 病的治疗；不含 Fc 段，副作用小；半衰期短，有利于毒素中和及清除。其 包括： （一）Fab 由一条完整的 L 链和一条约 1/2 的 H 链组成，只有一个抗原结合位点。 （二）Fv 和单链抗体（ScFv） Fv 由 VH 和 VL 构成，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段。 把 VH 和 VL 用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，使之表达为单一的肽链， 称为 ScFv。 （三）单区抗体及最小识别单位 单独重链可变区（VH）仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比 VL 大，称为单区抗体。
胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合 的成功率。浓度为 40％(W／V)的聚乙二醇 PEG1000~2000)是目前最常用的 细胞融合剂。
（二）选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。经融合过程后细胞将有多种形式出 现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。
HAT 培养基应用原理：细胞的 DNA 合成一般有两条途径。主途径 是由糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成 DNA。叶酸作 为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶 核苷存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK) 的催化作用合成 DNA。氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂。当氨基蝶呤存在时，能阻 断瘤细胞核酸（DNA）合成的主要途径。
二、T 淋巴细胞杂交瘤 T 淋巴细胞杂交瘤主要分为小鼠 T 细胞杂交瘤和人 T 细胞杂交瘤，由于 T 细胞功能的多样化，制备出的 T 细胞杂交瘤也各有其特性。如有可分泌各 种淋巴因子的 T 细胞杂交瘤；具有特异性杀伤功能的 T 细胞杂交瘤；能够 分泌 T 细胞抑制因子的特异性 T 细胞杂交瘤及自身反应性 T 细胞杂交瘤等。 其基本过程是将激活的 T 细胞与酶缺陷型 T 淋巴瘤细胞融合，通过有 限克隆稀释，可获得特异性表达 T 细胞受体(TCR)或其他功能的杂交瘤 T 细 胞。在技术要求上，其细胞融合、培养过程和 T 细胞胞杂交瘤的建立，基 本上与相应的 B 细胞杂交瘤技术相同。所不同的是细胞激活和阳性克隆筛 选较为复杂，T 细胞杂交瘤的稳定性不及 B 细胞杂交瘤，使其技术和应用受 到限制。主要步骤如下： 1．淋巴瘤细胞系的选择 作为融合用的瘤细胞要求有以下特性：①在体外能无限、快速生长； ②融合率高；③不分泌淋巴因子和杀伤功能；④缺乏某一特异性的 T 细胞 表面抗原或受体；⑤ HGPRT 酶缺陷型等。 2．特异性 T 细胞的制备与活化 主要有可溶性抗原诱导激活的 T 细胞、同种反应性 T 细胞和人的特异性 T 细胞等。 3．T 细胞杂交瘤的筛选 通常在含有 HAT 选择培养的基础上，亦可根据融合两亲本细胞特性选用 不同的方法。
教学重点、难点： 重点：熟悉制备单克隆抗体的基本技术；基因工程抗体的制备技术。 难点：杂交瘤技术的基本原理及 HAT 培养基的筛选机制
教研室审阅意见：
（教研室主任签名） 年月 日
基本内容
由一个仅识别一种抗原表位的 B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克 隆抗体（McAb）。其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生 物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易 于实验标准化和大量制备。单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。基因 工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识 Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用 DNA 重组和蛋白质工 程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码 Ig 分子基因进行切割、拼接与 修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。该抗体保留了天然 抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的 Ig， 具有更广泛的应用前景。
在细胞融合后，须经筛选去除无关细胞融合体。一是融合细胞的抗体 筛选，将融合细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一个孔中的细胞数 在理论上是一个，实际可能是 0 至数个，培养后取上清液以 ELISA 筛选出 特异性抗体高分泌性细胞，这一过程称为克隆化；二是将这些阳性细胞株 再克隆化，以 ELISA 重复检测，将阳性孔细胞株进行增殖，再进行冻存， 体外培养或动物腹腔接种。
（教案续页） 辅助手段和时间 分配备注
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基本内容
三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长的影响，必
须将阳性的杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经 反复 2～3 次检测上清液均为阳性的杂交瘤单个细胞才能进行克隆化培养。
克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应当及时冻存，以防止这些细胞染色 体丢失、发生变异以及细胞污染。冻存时保存液中小牛血清浓度为 20％， 再加入 10％的二甲基亚砜，最好保存在-196℃液氮中。
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基本内容
三、抗体融合蛋白 将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到具有多样性生物功能的融合 蛋白，并有多种不同的构建方式。 （一）含 Fv 段的抗体融合蛋白 将 Fv 与某些毒素、酶及细胞因子等的基因拼接，通过这些抗体的引导 可将其生物活性物质导向靶细胞特定的部位，更有效地在局部发挥生物学 功能而降低毒副反应。 (二)嵌合受体 将 ScFv 与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表达于细胞表 面，称为嵌合受体，其抗体部分与相应抗原特异性结合。 (三)含 Fc 的抗体融合蛋白 将功能性蛋白分子细胞膜外部分与 Fc 融合后用真核细胞表达，其融合 蛋白能以 Ig 类似的方式由二硫键连接成双体，分泌到细胞外。这种功能性 蛋白分子与抗体 Fc 的融合可产生两种效果：延长在血循环中的半衰期；通 过功能性蛋白与配体分子的作用，将 Fc 的生物学效应引导至特定目标。 四、双特异性抗体 通过基因工程技术构建的小分子抗体为单价，不能使抗原抗体偶联， 将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起则可得到双特异性抗体 (BsAb)。 (一)双特异性抗体的构建 1．双特异性抗体片段的体外构建 在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，两个不同抗体段通过此连 接可生成双特性抗体或称为双功能抗体。 2．双特异性抗体的细胞内组建 通过对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双抗体分子。目 前可采用几种方法：设计促进双聚体形成的结构域；在基因构建上直接将 两个抗体分子片段融合；设计两个 ScFv 的 VH 和 VL 相互配对，可产生双价 的抗体分子等。 (二)双特异性抗体的应用 1．在免疫检测中的应用 双特异性抗体的一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，应用于酶免疫 检测中，操作简化，质量提高。
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基本内容
细胞融合的选择培养液有三种关键成分：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸 腺嘧啶核苷(T)，所以三者取前缀缩写为 HAT 培养基。而融合所用的瘤细胞 是经毒性培养基选择出来的 HGPRT 阴性细胞株，所以不能在该培养基中生 长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传特性，可在 HAT 培养基中长期存活 与繁殖。 （三）有限稀释与抗原特异性选择
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基本内容
2．在肿瘤放射免疫显像中的应用 双特异性抗体一个臂结合肿瘤细胞表面抗原，另一个臂结合半抗原
螯合剂，后者选择与放射性核素结合，利用二次导向系统，增加了清晰度 和灵敏度。 3．双特异性抗体介导的药物杀伤效应
第二节 单克隆抗体的制备技术 杂交瘤技术制备 McAb 的三个基本原则：淋巴细胞产生抗体的克隆选择 学说，即一种克隆产生一种抗体；杂交瘤细胞保持双方亲代细胞的特性； 利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养 增殖，制备所需的各种 McAb。 一、单克隆抗体的产生 （一）动物体内诱生方法 为人体治疗、体外诊断或实验研究用单克隆抗体多采用该制备方法。 先在小鼠腹腔注射液体石蜡或弗氏不完全佐剂，1 周后将杂交瘤细胞悬液注 射腹腔，1～2 周后无菌方法抽取腹水，离心取上清液即可。 （二）体外培养法 这是实验室常用的 McAb 制备方法。将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，收 集上清液，这种方法制备的 McAb 极为有限，但可满足绝大多数的免疫学实 验要求。另一种方法是杂交瘤细胞大量培养，有两种类型，一类是悬浮培 养系统；另一类是细胞固定化培养系统。高密度培养可使单位体积 McAb 含 量明显增加，操作简便，不受动物干扰，价格便宜，有取代动物体内诱生 的趋势。 二、单克隆抗体的纯化 目前常用的纯化方法有：盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取 等方法达到纯化目的，也有采用较简便的酸沉淀法。最有效的纯化法为亲 合纯化法，常用葡萄球菌 A 蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联，制 备亲合层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可超过 90％。 三、单克隆抗体的性质鉴定 单克隆抗体分离纯化后的鉴定方法可包括：夹心型的放射免疫测定、 补体介导的溶血试验、ELISA、免疫酶染色以及玫瑰花结形成试验等。亦可 用沉淀试验和凝聚试验。现以 ELISA 方法最常用。