ImageJ软件在生物图像分析中的应用张雯婷医学神经生物学国家重点实验室神经生物学系2015年1月7日分割处理及其原理1 . 像素分类图像分割是把图像分成若干个按图像的某种特性（如灰度级，纹理等）的区域这样一种处理技术。
在每一个区域内都有相同或相近的特性，而相邻区域内的特性则不相同。
图像分割从本质上讲是将各像素点进行分类的过程。
分类所依据的特性可以是图像像素点的灰度值、颜色或多谱特性、空间特性或纹理特性。
门限化操作进行分类的过程是基于下列一个假设：每个区域是由许多灰度值相近的像素点所构成的，物体和背景之间或不同物体之间的灰度值都有着明显的差别，从而可以通过门限化操作来加以区分。
待分割图像的特性愈接近于这个假设，用这种方法分割的效果就愈好；否则，效果就愈差。
2 . 门限化从输入设备中获取的灰度图像（或彩色图像），是一种多值图像（对于8位数字图像来讲，其灰度可取256个不同数值），如果直接在其上面进行诸如面积、周长等颗粒特征参数的检测比较困难。
对于符合上述假设的图像来讲，在作具体检测前，通常首先要对它进行门限化操作以求得它的二值图像。
若阳性颗粒亮于背景（例如荧光激发的样品图像就是这种情况），则应通过下式操作得其的二值图像g t (m ，n)：⎪⎩⎪⎨⎧t <n) g(m,0-(2 N)0,1,2=n M;0,1,2=(m t >=n) g(m, 1=n) (m,g t if if 上述操作可分别用图(a)、(b)来表示。
若阳性颗粒内的各像素点的灰度值是介于门限t 1、t 2之间（灰度值低于t 1的往往是切片样品中的污物，而高于t 2的通常是背景和其他非阳性颗粒内的像素点），则必须通过式(2-20)操作得其的二值图像g t (m ，n)：⎪⎩⎪⎨⎧otherwise if 020)-(2 N)0,1,2=n M;0,1,2=(m t <=n) g(m,<=t 1=n) (m,g 21t 此操作如图(c)所示3. 门限选择对于阳性颗粒较暗、背景较亮的图像如果门限定得太高，则因有一部分背景像素点被归入颗粒而使在所形成的二值图像中的颗粒显得太“胖”（如图(b) 所示）如果门限定得太低，如果门限定得太低，则因有一部分颗粒像素点被归入背景而使在所形成的二值图像中的颗粒显得太“瘦”（如图(c)所示）门限ｔ的正确选择对于正确检测目标至关重要。
合适门限选择的依据——灰度直方图 如果图像内只含有一种类型的阳性颗粒，且其比较暗，而背景比较亮（反之亦然），其灰度直方图呈典型的双峰形状，在两峰之间存在着一个谷点。
取该谷点位置上的灰度值作为门限，并以此为界将图像中的全部像素点分为二部分： 谷点左侧的为阳性颗粒谷点右侧的为背景分别给于标记（某种颜色），获得只含有二种标记（阳性颗粒和背景）的分割图像。
确定门限的理论依据是：由于图像的灰度直方图通常呈正态分布，根据贝叶斯最佳判别准则，门限只有选在二个分布函数曲线的交点上，才能使所产生的判别误差最小（其值等于图中的阴影部分面积）。
如何进行图像分析？1、你的图像是什么性质？彩色图像还是灰度图像？Split channels, Color thresholding, Convert to 8bit grayscale etc2、你想获得哪些数据参数？Area, Number of particles, Intensity, Size/distribution of particles, Length etc 3、你想要测定的整幅图像还是某个特定区域？如何将你选定的ROI应用于其他图像？ROI manager4、如何分开重叠的颗粒？WatershedImageJ软件简介•ImageJ软件是由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health ，NIH）所属的国家精神健康中心（NIMH）的Wayne Rasband开发的一个基于Java的公共的图像处理和分析程序。
目前，可以运行于Microsoft Windows，Mac OS，Mac OS X，Linux和Sharp Zaurus PDA等多种平台。
•ImageJ支持图像栈功能，即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个图像，并行处理。
•ImageJ是免费、开放和多平台支持的软件，这成为该软件在世界范围内科学研究领域广泛应用的重要原因。
•不断更新的插件Plugins可以满足用户的各种需求•下载地址：/ij/download.html./ij/index.html软件安装及运行•下载ImageJ软件包，安装软件（刚刚下载的ImageJ软件包可能不是最新的版本，因此最好在首次下载安装ImageJ软件后，尽快对软件进行升级）•与大多数图像处理软件不同，Image J软件打开后，没有主要操作界面，而只出现一个命令对话框。
ImageJ软件的应用•测定面积•计算目标颗粒（细胞）的数目•Western blot分析•测定长度•伪彩图测定整体面积和ROI面积•打开需要分析的图像(8-bit，对于RGB图像需要进行split color操作)•设定阈值Image>Adjust>Threshold (Auto) 对于荧光染色图像要勾选dark background，红色部分为所设定的测定目标，按set键进行设定，apply进行确认应用。
•设定参数，对免疫组化阳性表达的面积分布、百分比分布、积分光密度、平均光密度、阳性细胞数量等参数进行量化。
弹出Set measurements对话框（Analyze->Set measurements），选择上述所要观察的指标，点击Ok确认•如果需要计算实际的阳性面积大小，可以设定图片的标尺Analyze>Scale设定单位(pixel to μm…)•Analyze> Measure 获得计算结果计算目标颗粒的数目（方法一）•选择Point Selection•选择标记细胞的标识所用的颜色Edit>Options>Colors>Selection（显著区别于计数目标的颜色）•打开Edit>Options>Point Tool，在对话框中选定Auto －Measure（可以同时调整label的大小）•点击选中的点将在Result窗口中显示其xyz的位置和灰度值等参数•打开需要分析的图像（8-bit，对于RGB图像需要进行split color操作）•设定阈值Image>Adjust>Threshold对于荧光染色图像要勾选dark background•Process/Binary/Watershed将重叠的部分分开•设定计算参数Analyze>Set Measurements,勾选Display Label •Analyze>Analyze Particles设定显示结果（设定颗粒的最大值和最小值）•在Results窗口中会看到对应每个点的相应参数（面积、xy的位置和直径等）包括颗粒的数目•优点：可以获得更多关于计数颗粒的信息•缺点：一次只能针对一种类型进行分析,计数误差比较大•打开Plugins>Analyze>Cell Counter•初始化initialize•选定细胞的type，如type1，点击计数同类细胞•对于另外一种类型的细胞，可以选定type2，点击细胞进行计数•Result显示每种类型中所计数到的细胞数目•Measure会显示所有计数过的细胞的类型、位置和灰度值等参数•优点：可以同时计数同一幅图像中所存在的多种类型的细胞分析凝胶电泳图谱（方法一）•打开文件, 在Image>Type下点击8-bit将图像转换为灰度图像，•在Process>Subtract Background，rolling ball radius的参数设定为50，去除图像的背景，这个值越小，减去的背景色越多。
•Analyze>Set Measurements，勾选Area，Mean Gray Value和Integrated Density •Analyze>Set Scale，长度单位设定为pixel•Edit>Invert(或Ctrl+Shift+I)来反转图像中的颜色。
此时，黑色区域变为白色，原来的白色区域变为黑色，正如上面勾选出的，使得测定的数值随蛋白表达量的增加而增加。
•选择freehand工具•在第一条带的周边画圈，你需要自己判断条带的边界，将目的条带与背景区别开。
•点击m键，计算所圈定区域的相关参数，结果将在弹出的result对话框中显示，所有在第4步中选定的参数将在结果中显示。
分析凝胶电泳图谱(方法二)•打开文件, Analyze>Gels>Gel Analyzer选项，勾选对话框中的Percentages, Outline Lanes和Invert Peaks。
•选择矩形选择框工具，在第一条带上画一矩形框（矩形框的高度大于宽度），包括目的条带上下的一定区域。
•点击1或Analyze>Gels>Select first lane，一个新的窗口将弹出，并出现新的选择框。
•使用箭头工具将方框移到下一条带，按2（或Analyze>Gels>Select next lane）将选择框移动到下一个条带，重复此项操作。
•完成后，按3或选择Analyze>Gels>Plot Lanes，弹出一个每一条带的profile plot窗口。
•选择直线选择工具，在每个峰的底部，画一直线，将峰变成一个封闭的区域，两侧为背景信号，如果有很多条带，后面的lane将被隐藏在profile plot的底部，如果需要看到这些条带，可以点击空格键，将鼠标向上拖动。
•当所有的峰都封闭后，选择Magic Wand工具。
•使用空格键和鼠标，拖动Profile Plot向下，使用Wand工具，点击峰的内部，重复此操作。
•选定峰后，Analyze>Gels>Label Peaks，将会计算并标记每个波峰的面积百分比，此值即为该电泳图谱上各个条带的含量百分比，然后在Results窗口中进行结果的复制和粘帖到Excel表格中进行统计。
/meijering/software/neuronj/•该软件是由Eric Meijering开发的，用于测量神经元突起长度的插件•下载neuron J软件，复制到Image J软件的Plugins文件夹中。
•打开Image J，并在Image J中打开Neuron J计算神经元突起长度•在Neuron J的界面中选择并打开所要分析的图像（file->open），需要强调的是，Neuron J只能打开8-bit的图像，如果原始图像不满足该要求，最好先用Image J打开图片，将其另存为8-bit的图像用于Neuron J分析。