4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可
取出接种。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
3、花药的消毒
➢70 ％ 酒 精 擦 洗 花 蕾 ， 或 浸 泡 数秒钟 ➢饱 和 漂 白 粉 上 清 液 ： 浸 泡 10 分钟；或次氯酸钠液2％～5％： 8～10分钟 ➢无 菌 水 冲 洗 几 次 后 ， 吸 去 水 分，剥取花药或胚珠接种。
➢ 光照强度：1000—3000lx，白色荧光灯，光的作用是满足
形态建成的需要（诱导）
➢ 相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调
整培养间湿度
第二章植物组织培养基本技术与设 施
2、定期检查和细胞学观察
➢接种后3～胞学观察：一般每隔3～5天观察一次。及时 记录。 ➢观察方法根据培养方式灵活掌握：
三、外植体的接种和培养
（一）无菌操作 （二）外植体的培养
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（一）无菌操作
➢植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分 离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作 过程，是一种无菌技术。
➢在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作 人员本身引起的。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒
➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。
➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～
10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中
加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟
➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准
讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把
工具在火焰上消毒。
➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖
前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖
第二章植物组织培养基本技术与设 施
1、接种室的消毒
➢污 染 的 主 要 来 源 是 空 气 中的细菌和真菌孢子
➢每次接种前半小时 ➢地面：用70％酒精喷 雾使空气的灰尘沉降。 ➢紫外线灯照射20分钟。
➢工 作 台 面 要 用 新 洁 尔 灭 或酒精擦洗。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
2、工作人员要求
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
自:曹孜义
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
4、根及地下部器官的消毒
➢预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污 染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。 ➢可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸 10～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接 种。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
上。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
3、材料的切取
➢ 切取和接种较大的材料肉眼观 察即可操作分离，较小的材料需 在双筒解剖镜下操作。
➢分 离 工 具 一 定 要 放 好 ， 切 割 动 作要快，防止挤压使材料损伤而 失败。
➢ 接种时要防止交叉污染的发生
第二章植物组织培养基本技术与设 施
4、 接种的具体操作
第一节 植物组织培养的操作方法概述
一、外植体的选择 二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养 四、外植体的成苗途径 五、污染的原因及其预防措施 六、外植体的褐变及其防止措施 七、培养物的玻璃化现象及其防止措施 八、试管苗的驯化与移栽
第二章植物组织培养基本技术与设 施
一、 外植体的选择
☺ 外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材
酒精擦拭手
浸泡5min
外植体消毒
酒精灯灼烧
器 械 消 毒
第二章植物组织培养基本技术与设 施
旋转灼烧
取外植体
接第种二章植物组织培养基本技术与设
施
盖好瓶塞
（二）外植体培养
1、培养条件：
➢ 温度：常保持在23±2℃，夜温低1—2℃
➢ 光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如 起始培养的前几天不需要光照）
料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。
☺ 外植体的选择依据
☺ 优良的种质 ☺ 健壮的植株 ☺ 大小适宜的外植体 ☺ 适宜的发育时期 ☺ 适宜的部位 ☺ 适宜生理状态和发育年龄的器官 ☺ 细胞培养材料的选择
第二章植物组织培养基本技术与设 施
二、外植体的灭菌
（一）常用灭菌剂的使用及其效果 （二） 外植体灭菌的一般步骤 （三）各种外植体的灭菌方法
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（一）常用消毒剂
消毒剂 使用浓度（％） 去除的难易 消毒时间（分） 效果
次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉
溴水 过氧化氢
升汞 酒精 抗菌素 硝酸银
9～10
2 饱和溶液
1～2 10～12 0.1～1 70～75 4～5（mg/L）
1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
第二章植物组织培养基本技术与设 施
后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
2、果实及种子的消毒
➢用自来水冲洗10～20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。
➢果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗2～3次。
➢种子要先用10%次氯酸钠浸泡 20～30min甚至几小时。对难以
消毒的还可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。
➢胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子 ，可先去掉种皮 ，再用