第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
(三)固体平板培养基配制程序 1.称量：天平 2.溶解：加热 3.调PH值：PH试纸、NaOH、HCl。 高压蒸汽灭菌 4.包扎灭菌： 5.倒平板：培养皿，超净台 6.固体平板培养基应倒置存放 用途：分离、纯化和计数
倒平板操作的讨论
1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动微生物的计数； 只能测量含量较高的样品； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
六.微生物数量的测定 2.稀释涂布平板法 (活菌计数法) 每毫升或每克样品菌数 = 菌落平均数×稀 释倍数÷稀释液体积(0.1ml) (待菌落数稳定时计数，菌落数少于活菌数) 3.滤膜法 (测活菌数) 饮用水中微生物的测定 已知体 过滤 滤 放入 伊红美蓝培 积的水 膜 养基培养 统计黑色 菌落数量
第一节.细菌的培养和分离
2.无菌技术实例
操作对象 操作空间(超净台) 培养基 玻璃器皿,金属用具 无菌技术 紫外线灯消毒 高压蒸汽灭菌（121˚C） 干热灭菌（160˚C）
接种环,涂布器,管口瓶口
接种,倒平板等实验操作 衣着和手
灼烧灭菌
在酒精灯火焰附近进行 酒精消毒
3.人工操作方法： 各种操作均应在超净台的酒精灯火焰附近进行
什么办法来估计培养基的温度？
用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时 即可开始倒平板。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基
表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表
面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培 养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿 盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？
为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上
滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
牛肉膏 5.0克 葡萄糖 10.0克 (1)根据用途分,该培养基称 乳糖 5.0克 为_____ 鉴别 培养基,利用该培养 KNO3 2.0克 基的目的是______________. 鉴别大肠杆菌 伊红-美蓝 0.2克 (2)根所物理性质分,该培养 琼脂 12.0克 固体 培养基,该培养 基称为______ 水 定容至 基可用于微生物的_________. 分离和计数 1000ml (3)该培养基中能提供碳源的是____________, 牛、葡、乳 能提供 牛肉膏、 KNO3 从培养基成分来分析,该培养基 氮源的是 __________, 所培养的微生物的同化作用类型为______ 异养型。配制该平 板培养基培养基的程序为称量、溶解、____________ 、 调PH值 _____________ 。 高压蒸汽灭菌 、____________ 倒平板
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
（3）为确定菌体产量，图中②操作之前，应先称量 _______________的质量。过滤后需反复烘干称量，直至 _____________________。所得菌体干重等于________。
生长因子
(微量有机物)
维生素、氨基酸、 碱基、核苷酸 PO43- SO42-等
生长不可缺少，自身已无 法合成(酶,核酸的组分)
水和无机盐
维持渗透压，PH，原料
牛肉膏,蛋白胨：分别是牛肉和大豆的水解产物（主要是多肽）。
问题讨论2：判断对错
同一种物质不可能既作碳源又作氮源。 凡是碳源都能提供能量。 除水以外的无机物仅提供无机盐。 能以氮气为氮源的微生物为_______生物。 能利用无机碳源的生物属于型_______生物， 在生态系统中充当________。 只能利用有机碳源的生物属于______生物， 在生态系统中充当________。
第一节.细菌的培养和分离
(二)培养基的类型
分类 类型
物理 液体 性质 固体
成分
无凝固剂 加凝固剂(琼脂)
作用
培养(扩增)、分离 分离,计数,鉴别
某化学物质有无，允许 分离特定微生物，如含青霉 选择 特定种类微生物生长， 素培养基能分离出酵母菌和 抑制其它微生物生长。 霉菌但抑制细菌放线菌生长 按用
重 复 多 次 直 至 获 得 目 的 菌
振荡培养若干天后，测定各瓶中化合物A的含量
固体培养基
（4）转为固体培养时，常 采用 的方法接种，获得 单菌落后继续筛选。 （5）若研究“目的菌”的 生长规律，将单个菌落进行 液体培养，可采用 的 方法进行计数，以时间为横 坐标，以 为纵 坐标，绘制生长曲线。 （6）实验结束后，使用过 的培养基应该进行 处 理后，才能倒掉。
同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。
问题4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析
其可能的原因。 无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可 能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了 污染。
第一节.细菌的培养和分离
四.无菌操作技术 1.方法
（1）消毒 用温和的理化方法（酒精、紫外线）来杀 死物体表面和内部的微生物。 （2）灭菌 用强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生 物（包括芽孢和孢子）。 1.灼烧灭菌 灭菌 2.干热灭菌： 3.高压蒸汽灭菌： 4.砂芯漏斗过滤灭菌（对尿素溶液）
练习：观察表格中培养基成 分数据，回答问题：
实验设计：
实验１：将Ａ接种于一般培养基，结果出现菌落。 实验２：用放射线处理Ａ，以产生突变体ａ1，将 其接种于一般培养基，不出现菌落。但在培养基中 添加物质甲后，就出现菌落。 实验３：另用放射线处理Ａ，得突变体ａ2，将其 接种于一般培养基，也不出现菌落。但在培养基中 添加营养物质乙后，就出现菌落。 实验４：将突变体ａ1和ａ2一起接种于一般培养基， 数日后出现菌落。 探究实验４中出现菌落的原因(要求：提出问题， 提出假说,设计实验程序，预期实验结果，分析相 应实验结果得出的结论)。
31。某化工厂的染水池中，含有一种有害的、难于降解 的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化 合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。 请分析回答问题：
（1）培养基中加入化合物的目的是 筛选 ，这种培养基属 于 培养基。 （2）“目的菌”生长所需的氮源和 碳源是来自培养基中的 ，实 验需要振荡培养，由此推测“目的菌 ”的代谢类型是 。 （3）培养若干天后，应选择培养瓶 中化合物A含量 的培养液，接入新 的培养液中连续培养，使“目的菌” 的数量 。
食品 主要 微生物 制作装 置或操 作步骤 A 果酒 酵母菌 B 果醋 醋化醋杆菌 （醋酸菌） C 腐乳 毛霉 D 泡菜 醋酸菌
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
（1）实验过程中培养白地霉的培养基是_________。 培养基定量分装前，先调节____________, 分装后用棉 塞封瓶口，最后______________________处理。 （2）图中 ① 过程称为__________，从甲到丁的培养 过程是为了_______。白地霉的代谢类型为_________。
未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，
菌落？它们的大小、形状、颜色相似？
如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、 形状、颜色相似的菌落。
问题3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？ 如果不同，请分析产生差异的原因？
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不
五.培养和保存纯化菌株
1.试管低温临时保存
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落
后，置于4OC的冰箱中保存。
2.甘油管长期保存 在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL
培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的
冷冻箱中保存。
六.微生物数量的测定
1.血球计数板计数法 （显微镜直接计数法） 缺点
样品菌数含量（个/ ml ）= 菌落平均数×稀 释倍数÷接处稀释液体积（ml） 练一练 某同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板 上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的 菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为 0.1ml）( A ) A.2.34× 108 个菌落/ ml B.2.34× 109个菌落/ ml C.2.34× 106个菌落/ ml D.23.4个/ 菌落ml
牛肉膏 5.0克 葡萄糖 10.0克 (1)根据用途分,该培养基称 乳糖 5.0克 为_____ 鉴别 培养基,利用该培养 KNO3 2.0克 基的目的是______________. 鉴别大肠杆菌 伊红-美蓝 0.2克 (2)根所物理性质分,该培养 琼脂 12.0克 固体 培养基,该培养 基称为______ 水 定容至 基可用于微生物的_________. 分离和计数 1000ml (3)该培养基中能提供碳源的是____________, 牛、葡、乳 能提供 牛肉膏、 KNO3 从培养基成分来分析,该培养基 氮源的是 __________, 所培养的微生物的同化作用类型为______ 异养型。
途分
加入指示试剂，使菌 鉴别菌种。如伊红-美蓝可 鉴别 落或菌落周围出现特 使大肠杆菌的菌落呈现出紫 定的颜色或形态变化。黑色。
配制何种培养基可选择出下列微生物?
土壤中的固氮微生物 能分解有机污染物A的细菌 分离土壤中能分解纤维素的细菌 分离土壤中能分解尿素的细菌 分离金黄色葡萄球菌（耐盐） 说出碳源和氮源即可。
七.微生物的分离纯化
平板划线法, 稀释涂布平板法, 选择培养基分离法,
鉴别培养基分离法。