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第十章 电泳


影响聚合的主要因素

引发剂和增速剂的浓度:浓度小易导致聚合速度慢;浓度 过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制 使聚合过程在40~60分钟内完成。 系统pH值:酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最 佳pH值,以获得最佳的聚合结果; 温度:低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可 以使凝胶透明而有弹性; 分子氧:分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合;抽气 系统纯度:金属离子会影响凝胶的聚合;
特点:设备简单、操作简便、测定快速、重复
性高、样品无需纯化。
SDS-PAGE 的原理
蛋白质分子的解聚
– SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助 溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键, 使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级、三 级结构; – 而强还原剂,如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
丙烯酰胺的聚合
丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成
的,通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素(引 发剂)来引发该过程;以N,N,N’,N’-四甲基 乙二胺(TEMED)为增速剂。
丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下
,产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由 基状态,经过一系列的自由基反应得到的聚合物 ;
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质
分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨 基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的 电荷量,消除了不同分子间的电荷差异; 同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同, 这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的 影响。
作为载体两性电解质应该具有以下特点:
– 应该是两性的,使它们在分离柱中也能达到一个平 衡位置; – 应该可以作为“载体”,两性电解质不能用于等电 聚焦,只有载体两性电解质,即具有好的导电性和 好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。
用于等电聚焦的主要载体两性电解质
Ampholine(瑞典LKB公司)
ห้องสมุดไป่ตู้
5 10 15
20
30~200 15~100 10~50
2~15
5 10 15
20
60~700 22~280 10~200
5~150
PAGE的具体操作过程

制胶:确定凝胶配方(凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓 冲液),使用灌胶模具灌胶; 样品准备:选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度 (1~2mg/L,考染),加样(溴酚蓝);
载体两性电解质pH梯度等电聚焦
等电聚焦(isoelectrofocusing), IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同, 在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋 白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白 质和两性分子。 根据建立pH梯度的原理不同,梯度有分为载体两 性电解质梯度(Carrier ampholytes pH gradient )和固相梯度。

凝胶浓度太大,孔径小于样品分子尺寸,电泳 时蛋白质分子不能进入凝胶,样品仍留在加样
位置;

凝胶浓度太小,孔径太大,样品中各种蛋白质
分子均随缓冲液推进,不能得到很好的分离;
凝胶浓度与分子量测定的关系
凝胶浓度 (C=2.6%) 分子量范围 (kDa) 凝胶浓度 (C=5%) 分子量范围 (kDa)
– 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组 成,它们具有连续改变的氨基与羧基比
Servalyte
(德国Serva 公司) (瑞典Pharmacia 公司)
– 产品Biolyte
Pharmalyte
– 产品分为九种pH范围
pH梯度的形成
在没有电场时,载体两性电解质的pH值大约是
该溶液pH范围的平均值,所有载体两性电解质 分子都荷电。
离子强度的选择
离子强度不宜过高,此时电导率低,产热少,电
泳速度快;但也不可过低,必须具有一定的缓冲 能力,过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。

一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间
凝胶浓度的选择


由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度,而 且取决于分子的大小、形状。因此,与凝胶的分子筛 效应(即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度)密 切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状,可以将凝 胶分为: – 非排阻性凝胶(unrestrictive gel):浓度0.7 ~1.0% 的琼脂糖凝胶; – 排阻性凝胶(restrictive gel):浓度大于1%的琼 脂糖凝胶和常规PAGE

工作原理
蛋白质的等电点
蛋白质最主要的特性是它的带电行为,它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电,只是 在某一pH时,蛋白质的净电荷为0,此pH即为该 蛋白的等电点(isoelectric point pI)。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象,
是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析

电泳洗脱仪:回收样品 凝胶扫描和摄录装置:对电泳区带进行扫描,从而给 出定量的结果。
垂直电泳槽及灌胶模具
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理:

由于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是多孔介质,不仅 能防止对流,把扩散减少到最低;而且其孔径大小与 生物大分子具有相似的数量级,能主动参与生物分子 的分离,具有分子筛效应。
第十章 电泳技术 Electrophoresis
本章主要知识点
电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些? 电泳装置的基本组成 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程
SDS-PAGE电泳的基本原理及过程
琼脂糖电泳的特点及其应用 等电聚焦电泳的基本原理 双相电泳的概念及其特点



电泳:4~6小时,待溴酚蓝前沿到达阳极底部;
检测:紫外扫描或染色(考马斯亮蓝R-250、银染色—灵 敏度比考染高100倍、荧光探针); 照相、凝胶干燥: 定量测定:

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白
质分子量的测定;
蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和 分子形状的改变
未知蛋白质分子量的测定
基于上述SDS-PAGE的原理介绍,我们可以利
用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测 定;
– 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不 同标准蛋白的电泳迁移率,制作标准校正曲线,然 后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳,测 定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量;
载体两性电解质在电场中 形成pH梯度的模式图
等电聚焦的主要应用
同工酶分离、分析
pI
测定
实际应用当中,等电聚焦的操作过程要复杂得
与化学特性。
电泳迁移率

电泳迁移率(mobility):在电位梯度E的影响下 ,带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
d m tE
其单位是cm2· -1 · -1 sec V 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物 质的基础

电泳的大致分类
依据电泳原理,现有三种形式的电泳分离系

– 移动界面电泳(moving boundary electrophoresis) – 区带电泳(zone electrophoresis ) – 稳态电泳(steady state electrophoresis )

分子筛效应
+
-
A
B
C
图中A,B,C均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MB>MC,所带电荷量相同QA=QB=QC。
琼脂糖凝胶的性能、结构与特点
其优点如下:

琼脂糖凝胶孔径较大,0.075%琼脂糖的孔径为800nm ,可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较 凝胶电泳低。 机械强度高:可以在浓度1%以下使用;
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳:粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、
聚焦电泳
– 无载体电泳:自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳

作为电泳支持介质必须具有 化学惰性 不干扰大分子的电泳过程
化学稳定性好
均匀 重复性好 电内渗小等特性

凝胶电泳的支持介质: – 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG) 由丙烯酰胺和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺在引发 剂和增速剂的作用下,聚合而成; – 琼脂糖凝胶: 从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部 分是由1,3连接的β-D-吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水αD-吡喃半乳糖交替形成的;
无毒; 染色、脱色程序简单,背景色较低;




热可逆性;
生物中性:一般不与生物材料结合; 电内渗(EEO)大:对于对流电泳有益
电泳系统的基本组成



电泳槽:是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、 垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V,载体两性电解质 等电聚焦电泳1000~2000V,固相梯度等电聚焦 3000~8000V 外循环恒温系统:高电压会产生高热,需冷却; 凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥; 灌胶模具:制胶,玻璃板和梳子; 电泳转移装置:利用低电压,大电流的直流电场,使 凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上, 如PVDF膜
当引入电场时,载体两性电解质分子将向阴极
或阳极迁移,带有最低等电点的分子(荷最多 负电)将最快地向阳极移动;当它达到净电荷 为0的位置时才停止,这个位置靠近阳极,由 于它具有高的缓冲能力,使环境溶液的pH等于 分子本身的pI。
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