饲养层细胞培养法
需要依赖于能分泌必需生长 因子的饲养层细胞。
体外培养ES和EG 细胞两大方法 无饲养层细胞培养法
以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含 FCS的正常 培养液，来替代饲养细胞。
（一）饲养层细胞培养法
取自各种品系小鼠的12dpc的胚胎，经剪碎和 MEF细胞 胰蛋白酶消化，常规分离细胞培养为单层散 布的成纤维细胞。经丝裂霉素C处理终止细胞
育速度和方式 存在较大差异。
猪取8－10天的胚泡， 绵羊取8－9天的胚泡，
人和牛取7－8天的胚泡。
体外授精胚胎或重构胚胎在体外培养至所需发育阶段时，也是 ES细胞培养的有效材料来源。
（二）无饲养层细胞培养法
直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF；
小鼠 ES 细胞 培养 液
Buffalo大鼠肝细胞条件培养液（BRL－CM）； 2－3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液（RH－CM）。
无饲养层的ES细胞培养系统
2－3份细胞条件培养液
1－2份新鲜的ES细胞培养液
10%－20%胎牛血清
组织发生
组织干细胞
全能干细胞 Totipotent stem cells
具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各 种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官。
八细胞阶段
多能干细胞 Multipotent stem cells
具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞， 即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有 自我增殖和分化两种功能。
o干细胞增殖具有自稳性，指干细胞会自我更新维持自身
数目的恒定，这是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。
发育早期―囊胚（受精后5－7天）中未分化的细胞。
囊胚含有约140个细胞，中心囊胚腔，腔内一侧为内细胞群
可以发育成各种组织器官，具有全能性。
当内细胞群在培养皿中培养时，称之为胚胎干细胞。
胚胎干细胞继续进行分化，形成专能干细胞
在胎儿、儿童和成人组织中的专能干细胞统称为成体干细胞
在特定的外加条件下，一种组织的的成体干细胞可以“横向 分化”成其它组织的功能细胞。
干细胞分化为不同血细胞
（四）干细胞的特点
干细胞具有自我更新和分化潜能。 干细胞体积小，核质比例大，端粒酶活性高，能无限增殖。 干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。
骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血
干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。
专能干细胞
多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化 成某一类型的细胞。又称单能干细胞。
如表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。
胚胎干细胞 Embryonic stem (ES) Cells
来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于 胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更 新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分 化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化 细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞 (Multipotent stem cells )。
全能性胚胎性干细胞
胚胎干细胞
多能性胚胎性干细胞
能诱导分化为几乎所有类型的细胞，具有很强的生物学可塑性， 已属于多能性，略强于组织干细胞。
胚胎性癌细胞，EC embryonal carcinoma cell 多能性胚胎干细胞， EG embryonic germ cell
全能性胚胎干细胞， ES embryonic stem cell
组织干细胞 Tissue-specific stem cell
指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某
种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞
(Adult stem cells)。
（三）干细胞分化发育
o干细胞的增殖速度一般比较慢。
o一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化过程，以适应组
织器官生长、发育和修复的需要，当干细胞进入分化期时， 其增殖速度开始逐渐加快。
基本概念 干细胞分类
一、概述
干细胞分化发育 干细胞的特点 胚胎性干细胞类型
（一）基本概念 干细胞
o干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 o包括胚胎干细胞和成体干细胞。 o干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。
（二）干细胞分类 功 能
多能干细胞
全能干细胞 专能干细胞
干细胞
胚胎干细胞
干细胞通过两种方式生长。
形成两个相
同的干细胞。
对称分裂 两种方式生长 非对称分裂
调节分化蛋白不均匀地分配，一个子细胞不可逆的走向分化终
端成为功能专一的分化细胞；
另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。
（五）胚胎干细胞类型
在胚胎发育最早阶段，各个卵裂球发育潜能几乎是等同的，每 个细胞可独立地产生完整的机体；
组织来源
二、ES细胞和EG细胞培养建系技术
饲养层细胞培养法 无饲养层细胞培养法 胚胎细胞来源
ES细胞和EG细胞的培养过程 ES细胞和EG细胞系的特性和鉴定
o体外培养建系ES细胞和EG细胞的技术以小鼠最为成熟，成功
率最高。
o培养原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团，并建立体
外适合其增殖和抑制分化的培养系统。
o早期胚胎细胞离体后极易发生分化，解决阻止其分化、确保
维持其全能性或多能性是关键。
饲养层细胞（feeder layer） 特殊细胞的条件培养液（conditioned medium） 分化抑制因子（differentiation inhibitory factor，DIF）
分化抑 制物
原代或初期培养阶段一般都
常 用 的 饲 养 层 细 胞
STO细胞
分裂后，用作ES细胞培养的饲养层。
来自SIM小鼠（S）胚胎的对硫代鸟嘌呤 （tyioguanine,T）和乌本苷（ouabain,O）有抗 性的成纤维细胞系，主要分泌干细胞生长因子 （SCF）和白血病抑制因子（LIF）。
用作ES细胞或EG细胞培养的饲养层的MEF或STO细胞均需用 10mg/L丝裂霉素C在37℃处理4h，用前经PBS彻底洗涤。
在胚胎干细胞原代和建系初期，培养ES/EG细胞的成功率不
高，还需补充适当的生长因子。建系成功后，可使用无饲养层
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
培养法。
不同种属的ES/EG细胞对生长因子的要求不同，如人ES细
胞不能和LIF起反应，难以抑制人ES细胞的分化。
（三）胚胎细胞来源
小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚，
不同胚胎发