微滴培养板：在塑料培养皿中用受精液做成20-40 μL的微滴，上覆蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵
母细胞10-20枚及获能处理的精子 (1.0-1.5)×109L-1
，在培养箱中孵育6-24 h。
胚胎质量评价标准

Ⅰ级胚胎：胚胎卵裂球均匀规则,胞质均匀透明,透明带完整,
胚胎无或仅有极少(<10%)的碎片。
第五课 人胚胎与胚胎干细胞的培养
引言
自1998年Thomson实验室建立首株人ES细胞系以来,全世 界范围内已经相继建立1200多株不同的人ES细胞系。然而, 研究者们仍致力于建立新的人胚胎干细胞系,尤其是HLA配型 及各种族人群的。

很多声称衍生出的人ES细胞并没有严格的特征描述和评估
。列于NIH干细胞注册协会中的只有21株有证实的特征描述
胰酶分散传代

在hES克隆较多时，可采用胰酶（0.05%胰酶/EDTA) 进行传代。

最安全的方法是选择6孔板中形态良好的亚克隆，机 械法挑取50-100个克隆，转移到新孔备份；同时剔 除已分化克隆；在原孔中加入胰酶消化，然后转移 到同样直径的新孔；5-7天后可进行下一次传代。

第二次使用胰酶消化时，可以1:3传代。
hES细胞的标志物的检测

免疫细胞化学分析，综合它提供的有关细胞形态和 抗原位置等信息，检测未分化hES标志物的表达情况。 表面标志物的流式细胞检测，流式细胞能够提供培 养物中表达干细胞标志物的细胞数以及其染色强度 的信息，多种抗体和检测通道，可以同时获得多个 标志物的信息。 定量RT-PCR检测，在缺乏相应特异性抗体时可以检 测相关基因表达的替代方式。
三、hESCs细胞系的特征描述
hES细胞形态的一般特征

目前使用的有饲养层和无饲养层方案都会产生混合 细胞群，其中包含因自发性分化而出现的多种形态 细胞。

典型的未分化的hES细胞，通过细胞与细胞之间的 缝隙连接而形成“紧密”的克隆，克隆中细胞核仁 明显，核/质比例高。
长期培养后（＞50代），未分化克隆相互接触， 可以在低倍镜下看到相对均匀的薄层。
人受精卵到囊胚的发育过程（0-5d）
A 两细胞胚胎 B 8细胞胚胎 C 紧束化囊胚 D 扩张的囊胚
人囊胚的各种形态
早期囊胚 腔化囊胚
扩张囊胚
孵化囊胚
内细胞团的各种形态
A 由紧密紧束的多个细胞组成 B由若干细胞构成，细胞不紧束 C 少量细胞 D没有真正的ICM
滋养层细胞的各种形态
E具有完整的、黏附上皮形成的单细胞层 F 单细胞层不完整，有线性区域 G 仅少量大细胞 H仅有退行性变的细胞


制备用于共培养的子宫内膜培养物

通过导管获得子宫内膜活检组织，剪碎，0.1%胶原酶消化1h 。静置，去掉上清，用DMEM重悬沉淀并洗涤3次。

含1%人血清白蛋白HSA的DMEM重悬细胞团、培养瓶中孵 育15分钟。将上清转移至新培养瓶，并加入3ml 1% HSA的 DMEM孵育15分钟。


再次收集所有上清放置于试管中，确定总体积。
5.0%CO2、37 ℃培养箱中继续培养4-9 h。
胚胎体外培养常用方法

悬滴培养法(盖玻片或凹载片)
旋转管培养法(管状培养器皿) 灌注小室培养法(两个盖玻片或金属圈) 培养瓶培养法 培养板培养法
培养板培养法

四孔培养板：在每孔加入500 μL受精液和100-150 枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子 (1.0-1.5)×109L-1，在培养箱中孵育6-24 h。
早期hES细胞的冻存—玻璃化法

早期细胞克隆尤其珍贵，需要及时冻存。但
由于细胞数目较少，传统慢速冷冻-快速复温
方法不太适用。

原理：通过逐步增加蔗糖和DMSO冷冻液的
浓度来保护细胞，减少细胞内的冰晶形成。
玻璃化法冻存步骤
按照传代大小2倍 体积切割细胞团块
hES-HEPSE 培养基1ml hES-HEPSE培 养基+10%乙二 醇+10%DMSO hES-HEPSE培 养基+ 25%1M蔗糖溶液 +20%乙二醇 +20%DMSO
试剂：尽量使用已有的hES细胞系的常规培养
物进行测试。
饲养层：和小鼠ES细胞制备一样，使用新鲜
制备，代数较低的小鼠MEF细胞。
内细胞团的分离

将新鲜获得或冻存-复苏的人类胚胎在序贯培养基中
培养至囊胚阶段。采用酸性Tyrodes溶液孵育溶解
透明带。

可采用免疫外科学方法、显微外科学方法、组织培
养法等方法在饲养层细胞上得到内细胞团衍生的细
序贯培养
研究表明：胚胎培养的不同阶段，对营养需求不同。
序贯培养基由两种不同的培养基构成。第一种培养
基用于支持受精卵到8细胞期的发育，含相对高浓度
的丙酮酸盐、乳酸盐和相对较低的葡萄糖；第二种用
以协助8细胞期到囊胚期的发育，含相对高浓度的葡
萄糖和相对较低的丙酮酸盐、乳酸盐。
共培养方案

虽然胚胎培养基有了很大的发展，但体外发育的总 体情况仍然落后于体内发育。 可以使用多种细胞包括输卵管、子宫内膜、卵丘细 胞、颗粒细胞等和胚胎共同培养的方案加以改进。 优点：参与共培养的细胞能够分泌胚胎营养因子、 生长因子和细胞因子等，以及消除潜在的有害物质 （重金属、铵和自由基等），降低培养基中的毒物 。
未分化hES细胞的核型分析
某些维持培养在有饲养层和无饲养层条件下的 hESC培养物出现了异常核型，所以应该常规进行 核型分析 (Karyotype Analysis)。 hESCs的核型分析步骤和方法与一般体细胞或小 鼠ESCs基本一致
酶活检测

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP) 活性 检测广泛用于确定细胞是否处于未分化状态 的标志之一。
宫内膜上皮细胞的24孔培养板上共培养。培养基IVF
：CCM (coculture media)=1：1


3d 评估胚胎发育状态，使用CCM培养基
5-6d 对胚胎进行形态学分类。
二、人胚胎干细胞的 衍化生成和维持培养
建立hES细胞系的流程
衍化hES细胞系的准备工作
仪器：显微镜、培养箱、超净台 比一般细胞培养更严格的无菌环境。
将700-800μl的子宫内膜上皮培养基和200-300 μl带有细胞的
上清混合加入培养孔。

培养4-6天至铺满，即可用于胚胎的共培养。
子宫内膜上皮细胞培养物
A 0d；B 细胞增殖 C 4-6d形成单层
共培养流程


0-1d 分离卵母细胞，确定受精，使用IVF培养基
2d 评估胚胎是否处于卵裂期，将胚胎放置于铺满子
，可以用于广泛的学术交流。
内容提要

人胚胎培养

人胚胎干细胞的衍化生成与维持培养 人胚胎干细胞的特征描述

hESC建系使用的胚胎来源

体外受精IVF或单精注射等辅助生殖技术中的剩余胚胎,经患 者知情同意后，可以用于科研，建立hESCs

患者已成功妊娠或由于其它原因而放弃的新鲜或冻存胚胎。

一些评分较低，不适于移植的胚胎。
，以维持同源整倍体细胞群的稳定。
衍化生成携带特定基因缺陷的 hES细胞系

植入前基因诊断PGD是为携带遗传病的夫妇设计的诊断检
查，用以确保植入健康的胚胎。需要将胚胎在体外培养至6-
8细胞期，取出其中的1-2个用于PCR或荧光原位杂交试验
。

来自PGD的胚胎可以发育至囊胚阶段，目前已有5个hES细 胞系是从PGD剔除的囊胚衍化而来，具备hES的全部特征 ，在分化后可以用做疾病模型加以研究。
hES具有高端粒酶活力，与其长期的增殖能 力以及表达hTERT的特征向吻合。可以通过 端粒重复扩增方案TRAP检测端粒酶活力。

未分化hES细胞的标志物

针对细胞表面抗原的标志物，如阶段特异性胚 胎抗原SSEA-3和SSEA-4，蛋白聚糖抗原的 TRA-1-60和TRA-1-81等。

多能性的分子标志物，如Oct3/4、Sox2、 Nanog、UTF-1等。

最好hES的接种密度 高质量的hES克隆的外观
Morphology of a hESCs colony cultured in different culture conditions. (A) With MEFs, (B) with foreskin fibroblast, and (C) in animal-, serum- and feeder layer-free conditions.
hES-HEPSE 培养基1ml 5分钟
hES的冻存和复苏
hESCs长期培养导致的核型变异问题

hES细胞的未来应用，无论是科学研究还是临床治疗，都要
求保持稳定的核型。

尽管有些hES细胞系培养到107代时仍然能保持正常核型， 但随机的核型变异仍然可能发生。

目前已有几篇报导发现连续培养导致细胞核型异常。这可能 是由于培养物中原有一个异常核型的亚细胞群在培养过程中 获得了生长优势。因此，有必要将培养hES细胞定期克隆化

经验表明，高质量的胚胎衍化效率更高，因此最佳的人胚胎
培养体系就成为所有衍化实验室工作效率的关键。
受精卵制备

取卵后三四小时，将精子和卵子放在一起进行体 外受精或进行单精子卵细胞浆内注射。

从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密
度的精子制备液，按照(3-5)×104个精子/每个卵
子的比例加入精子，将受精培养皿放回体积分数
60s 液氮 保存
10%玻璃化 溶液1ml