附录：常用试剂配制及应用一、常用缓冲液、试剂的配制碳酸盐缓冲液(Carbonate-Bicarbonate Buffer)由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）。

附表1. 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）磷酸缓冲液(Phosphate Buffers，PB)磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，PO4：pKa1＝2.12，pKa2＝7.21；所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽。

NaH2HPO4：pKa1＝7.21，pKa2＝12.32。

Na2另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。

磷酸缓冲液的优点为：①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如0.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。

磷酸缓冲液的缺点是：①磷酸盐易与钙离子（Ca2+）、镁离子（Mg2+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。

NaH2PO4的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。

Na2HPO4的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。

而pH＝6～8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaH2PO4与Na2HPO4两种磷酸盐混合配制（附表2）。

附表2. 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.2）磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-buffered saline, PBS)磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。

NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g在800ml蒸馏水中溶解，用HCl调节溶液的pH值至7.2～7.4加水定容至1L，15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存备用。

Tris缓冲液（Tris-HCl Buffer, TB）Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCl调节pH至所需值，Tris-HCl 缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的0.05 mol/L Tris缓冲液的配制是将50ml 0.1 mol/L Tris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的0.1 mol/L HCl混合，加水至将体积100ml，即为0.05 mol/L Tris缓冲液。

另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所需略有差异，此时可通过稍许减少或增加HCl用量，精细调节pH至所需值。

附表4. 0.05 mol/L Tris缓冲液Tris盐缓冲液（TBS）：Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压，因此，TBS也适用于做细胞缓冲液，常用TBS配制如下。

8g NaCl、0.2g KCl以及3g Tris溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015g酚红并用HCl调pH至7.4用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min，室温保存。

现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液如果不用于细胞培养，通常不加KCl及酚红。

Hank’s液 (Hank’s Balanced Salt Solution)Hank’s液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。

贮存液A液：(I)NaCl 80gKCl 4gMgSO4·7H2O 1gMgCl2·6H2O 1g用双蒸馏水定容至450ml。

(II)CaCl2 1.4g (或CaCl2·2H2O 1.85g)用双蒸馏水定容至50ml。

将I和II液混合，即成A液。

贮存液B液：Na2HPO4·12H2O 1.52g，KH2PO40.6g,酚红 0.2g,葡萄糖 10.0g,酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至500ml。

(3)应用液：A、B储存液分别经112.6℃湿热灭菌20min，取A和B液各25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，使用前用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。

注意：药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。

无Ca2+、Mg2+ Hank’s液（Hank’s Solution without calcium, magnesium sulfate）NaCl 80g,KCl 4g,Na2HPO4·12H2O 1.52g，KH2PO40.6g,葡萄糖 10g,用双蒸馏水溶解后，加入0.4％酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml，112.6℃湿热灭菌20min，4℃ 冰箱保存。

临用前将原液用无菌双蒸水作1：10倍稀释，用无菌的3.5%或5.6% NaHCO3调至所需pH。

pH7.2柠檬酸盐缓冲液(Citrate Buffer)柠檬酸 0.327g柠檬酸钠 2.63g磷酸氢钠 0.222葡萄糖 0.00255mg蒸馏水加至100ml。

pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citric acid- Phosphate Buffer)0.131mol/L citrate acid，0.066mol/L Na2HPO4，等量混合，调节pH至3.3。

0.5 mol/L EDTA, pH 8.0EDTA·2H2O 186.1 gNaOH ～20 g将EDTA·2H2O加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。

用NaOH调节pH 至8.0，EDTA直到接近pH 8.0才完全溶解，定容至1L。

分装后高压蒸汽灭菌。

0.4%酚红溶液取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/L NaOH溶液11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4℃ 冰箱保存。

醋酸钾（Potassium Acetate）在60ml 5mol/L醋酸钾溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。

该溶液用于碱性裂解。

3mol/L 醋酸钠（Sodium Acetate），pH5.2和pH7.0在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0，加双蒸水至1L。

分装后高压灭菌。

柠檬酸钠缓冲液(Sodium Citrate Buffer)柠檬酸钠 1.8gHCl(1mol) 4ml无水乙醇 95ml先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCl和无水乙醇，再补充去离子水至总量200ml。

饱合硫酸铵溶液(Saturated Ammonium Sulfate Solution)取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70℃，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用NaOH）调pH7.2，室温保存。

二、酶免疫检测常用试剂配制包被液(Coating Buffer)（pH9.5碳酸盐缓冲液）Na2CO3·10H2O 8.58gNaHCO35.8g溶于双蒸水至1000ml。

封闭液(Confining liquid)（5%脱脂乳-PBS溶液，pH7.4）脱脂乳 50g加0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）至1000ml溶解。

洗液(washing liquid)氯化钠 8.0g磷酸二氢钾 0.2g磷酸氢二钠（12H2O） 2.9g吐温-20 0.5ml加去离子水至1000ml溶解即可。

终止液(stop buffer)（2mol/L H2SO4）：21.7ml H2SO4加去离子水至200ml。

缓冲甘油(glycerine buffer)甘油 9份PB（pH8.0） 1份将9份甘油与1份PB合并，充分混匀。

0.5%H2O2-甲醇液(Hydrogen Peroxide-Methanol Solution)（总体积120ml）3%H2O220ml甲醇 100mlDAB-H2O2底物缓冲液(DAB- H2O2Substrate Buffer)取6mg二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride DAB)溶解于10ml 0.05mol Tris-HCl pH7.6。

使用前取0.3%H2O20.1ml加入到DAB溶液中(H2O2的终浓度为0.003%)。

如有沉淀生成，则用滤纸过滤。

5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBT Substrate Solution）贮存液配制：NBT：在10ml 70%的乙醇中溶解0.5g NBT。

BCIP：在10ml 100%二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP。

贮存液4℃保存，可稳定一年。

底物显色液：取66μl NBT贮液与33μl BCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在用前1小时内配制。

三、细胞相关试剂配制L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutamin Solution）（0.2 mol/L）称2.9 g L-谷氨酰胺（分子量为146.15）用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5 ml/瓶，-20℃冻存。

100x青-链霉素（双抗）溶液（P/S Penicillin/Streptomycin Solution）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1 g，溶于100 ml去离子水中，分装小瓶，4～5 ml/瓶，-20℃冻存。

7.5% NaHCO3溶液（NaHCO3Solution）称分析纯NaHCO37.5 g，用去离子水溶解至l00ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5 m1/瓶，盖紧瓶塞，4℃保存。

HEPES溶液（HEPES Solution）（1mol/L）称23.83 g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量为238.3），用去离子水溶解至100 ml，过滤除菌，分装小瓶，4～5 m1/瓶，4℃保存。

氨基喋呤（A）贮存液（Aminopterin Stocking Solution）（100×, 4×10-5mol/L）称1.76 mg氨基喋呤（Aminopterin, 分子量440.4），溶于90 m1去离子水中，滴加l mol/L NaOH 0.5 m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1 mol/L 的HCl 0.5m1中和，再补加去离子水至100 m1。