以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等 的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是 一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度） 等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结 合的合适温度。
2、ELISA操作要点
严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器 是保证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
五、注意事项
1、基本操作注意事项
加样:
在ELISA中一般有3次加样步聚，即加样本，加酶结
合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部
，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
1、基本操作注意事项
保温:
抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(或孵育
incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面 上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？
1、基本操作注意事项
洗涤:
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着 实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的 干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的 ，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤 下来。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的 酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免 疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性， 又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗 体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗 涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中 的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过 反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中 受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底 物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质 的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分 析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的 结果，使测定方法达到很高的敏感度。
猪瘟抗体ELISA检测
2015年12月
提 纲
1
ELSA基础知识 猪瘟抗体检测ELISA原理 实验前准备
2 3
4
5
操作过程
注意事项
一、ELISA概念及类型
50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫 （RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来 标记抗原或抗体的分析技术 1971年此项技术由瑞典学者 Engvall 和Perlmann， 荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道，将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定 方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA）
三、实验前准备
常用仪器
洗涤液配置：浓缩洗 涤液用蒸馏水或去离 子水25倍稀释。 用CSFV样品稀释液 20倍稀释待检样品 使用前所有试剂盒组 分应恢复到18-26℃， 并震荡混匀。
四、猪瘟ELISA操作过程
1、移板：在CSF 抗原包被板上加入 各100vl阴、阳性 对照，阴阳性对照 设复空。在相应空 中加入100vl已稀 释好的样品，封板 37℃温育30min。
在ELISA方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” （conjugate）； （3）酶反应的底物。
几种常用的ELISA检测方法
双抗体夹心法测抗原（常用） 夹心法 双抗原夹心法测抗体 间接法测抗体（常用） 竞争法测抗原 竞争法 竞争法测抗体 捕获包被法测抗体 亲和素-生物素 ELISA法
二、猪瘟抗体检测ELISA实验原理
☆ 包被板上包被的猪瘟(CSF)抗原，可与待测样品中
的特异性抗体（抗-CSFV）反应，形成抗原抗体复 合物被吸附到固相上，再加入酶标记的抗猪IgG， 形成“固相猪瘟病毒抗原-猪瘟病毒抗体-抗猪IgGHRP”免疫复合物，洗涤后，如待测样品中含有猪 瘟抗体，加入显色液即显色，为阳性；反之为阴性。
边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规 定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显
色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无
色。
1、基本操作注意事项
酶标仪:
酶标比色仪简称酶标仪，主要性能指标有：测读速 度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性 等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确 性为±1%，重复性达0.5%。 操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。测读值时，要选用产物的敏感 吸收峰，如本实验用450nm波长。有的酶标仪可用双波 长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明 书。
6、每孔加入50vl 终止液，终止 反应。 7、测量并记录样 品和对照的OD 值（450nm）
结果分析
1、实验成立条件 阴性对照值=（NC1+NC2）/2 阳性对照值=（PC1+PC2）/2 实验成立条件：阳性对照平均值-阴性对照平均值≥0.1，阴 性对照平均值≤0.1。 2、结果判定 样品计算 S/P=(样品-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值 -阴性对照平均值） S/P值＜0.4,样品判定为CSFV抗体阳性。 S/P值＞0.4,样品判定为CSFV抗体阴性。
2、洗板，弃去各空液 体，280vl/孔已稀释 洗涤液洗涤板空， 共洗5次，每次洗涤 后弃孔内液，最后 一次将板空洗涤液 拍干。 3、加酶结合物，每孔 100vl，封板37℃温 育30min。
4、重复步骤2洗板。 5、每孔加入50vl显 色A液和50vl显色 B液（也可A、B 显色液等比例混 合后加入100vl）， 封板37℃温育 10min。
可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。
1、基本操作注意事项
显色:
显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应
。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间
内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈 色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，