4.3.4 与类似菌鉴别
本菌在生化性状上与苏云菌芽胞杆菌极为相似,但 后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其 检查方法如下:取营养琼脂上纯培养物少许,加少量 蒸馏水涂于玻片上,待自然干燥后用弱火焰固定， 加甲醇于玻片上,半分钟后倾去甲醉,置火焰上干燥， 然后滴加0.5碱性复红液，并用酒精灯加热至微见 蒸气维持l.5min，移去酒精灯,将玻片放置半分钟， 倾去染液,置洁净自来水充分漂洗、晾干、镜检。 在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红 色结晶小体（如未形成游离芽胞，培养物应放室温 再保存1d-2d后检查）如有即为苏云金芽胞杆菌,蜡 样芽胞杆菌检查为阴性。
4.操作步骤
4.1 菌数测定 以无菌操作将检样25g (m1)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 做成 10-1-10 -5 的稀释液按GB/T4789.2测定。取各稀释液。0.1m 接种在两个选择性培养基-甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上 用L形棒涂布于整个表面，置3 6 ℃士1 ℃培养12h -20h ，选取适 当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养幕上的菌落为粉 红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶 。计数后，从中挑取五个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽 胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数， 即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如：将0.1m1的 样品稀释液涂布于MYP平板土，其可疑菌落为2 5个，取五个鉴定， 证实四个菌落为蜡样芽胞杆菌，则1g( ML ） 检样中所含蜡样芽 胞杆菌数为： 2 5 X 4 /5 X104 X10＝2X106
酸而使其由半固体转化为液态状。
生化特性
• 根状生长试验：挑取单个可疑菌落划线接种于
营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。
•
蕈状芽胞杆菌
蜡样芽胞杆菌
根状生长
Hale Waihona Puke 30℃，24h 培养，室温 放置3天后根 状生长观察 。
蛋白质毒素结晶试验
• 取经30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h并于室温放置3 d～4 d的营养琼 脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然 干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥， 于载玻片上滴满0.5％碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使 染液沸腾)持续1 min～2 min，移去火焰，再更换染色液再次加温 染色30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。 • 观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其 它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应将培养 物置室温2 d～3 d再行检查。放置3d～4d以上的苏云金芽胞杆菌 培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色方法 才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置 几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。
4 .2 分离培养 取检样或稀释液划线分离于选择性培养基（MYP) 上置37℃培养12h-20h，挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌 落（见6.1) 接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养， 然后做证实试验。
4. 3 证实试验 4.3.1形态观察 本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在1um或 1um以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位 于菌体中央或稍偏于一端。
蜡样芽胞杆菌的检测
革兰氏阳性杆菌，菌体两端钝圆，有 鞭毛，无荚膜，多成链状排列。
形 态 色与 染
本菌生长6小时以后即可 以形成芽孢，形成的芽 孢小于菌体横径，位于 中心或稍偏于一端。
芽 孢
引起食物中毒的原因－肠毒素
• 一种大分子量蛋白——腹泻型综合症,能在各种食 物中形成; • 小分子量、热稳定多肽——100度30分钟不能被破 坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中
食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验 （修订版）
《修订版》最佳生长温度30～32℃
• 经标准修订协作组验证：
蜡样芽胞杆菌在MYP培养基上
培养条件
30 ℃±1 ℃ 48h 30 ℃±1℃ 24 h 36 ℃±1 ℃ 24 h
平均生长率
93.69% 92.28% 82.32%
《修订版》 6.2.4 溶菌酶耐性 试验
苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血 现象；巨大芽胞杆菌不溶血；炭疽芽胞杆 菌通常不溶血
。
生化特性
• 触酶实验：产生过氧化氢酶分解过氧化氢生成
水和氧气。
• 产生酪蛋白酶：分解培养基中的酪蛋白，生成
L-酪氨酸在菌落周围形成透明圈。
*阴性反应时继续培养72h再观察
（炭疽芽胞杆菌通常不分解酪蛋白）
• 产生明胶酶： 将明胶水解为多肽再水解为氨基
形成。
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蜡样芽胞杆菌（营养琼脂）
蕈 状营 养 芽琼 孢脂 杆 菌
( 48h)
巨大芽孢杆菌（营养琼脂）
蜡 样 芽 胞 杆 菌
菌 体 ， 游 离 芽 胞
蕈 状 芽 胞 杆 菌
菌 体 ， 游 离 芽 胞
巨 大 芽 胞 杆 菌
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生化特性
• 不发酵甘露醇：在甘露醇-卵黄-多粘菌素 （MYP）琼脂平板上生成微粉红色菌落。
生化特性
• 产生卵磷脂酶：分解MYP琼脂中的卵磷脂， 在菌落周围产生粉红色混浊环（沉淀环）。
生化特性
• 产生溶血素：使胰酪胨大豆羊血琼脂 （TSSB）中的血细胞发生β溶血。
完 全 溶 血 环
蜡 样 芽 胞 杆 菌
4.3.2 培养特性 本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环， 振摇易乳化； 在普通琼脂平板上其菌落不透明、 表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐。 4.3.3 生化性状及生化分型 4.3.3.1 生化性状 本菌有动力； 能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶； 过氧氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木 糖；常能液 化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发 酵葡萄糖。 4.3.3.2 生化分型 根据蜡样芽胞杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐 还原、淀粉水解、V- P反应、明胶液化性状的 试验，分成不同型别， 见表下表.
• 用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中， 36℃（or30）±1 ℃培养24h。蜡样芽胞杆菌在本 培养基（含0.01％溶菌酶）中能生长。如出现阴性 反应，应继续培养24h。巨大芽胞杆菌不生长。
苏 云 金 芽 胞 杆 菌
游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。
蛋 白 质 毒 素 结 晶
苏 云 金 芽 胞 杆 菌
蛋白质毒素结晶形态观察
芽孢形成期的菱形晶体蛋白 扫描电镜观察（20kv，9.5mm＊15.0k）
光学显微镜观察 100倍油镜
生化特性
3.蜡样芽胞杆菌检验程序