Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。

实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。

2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。

使用终浓度为1 mmol/L 。

【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。

PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。

凡被PMSF 污染的衣物应予丢弃。

】二． 蛋白定量试剂： 1. BCA 蛋白定量试剂盒2. 10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl 溶于10ml 去离子水中） 三． 上样用试剂： 6×SDS 上样缓冲液：取一个离心管，秤取2.0g SDS 粉末，6mg 溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL 1.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)，用移液管加入10mL Glycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mL β-mercapteethanol （β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml ，涡旋溶解。

4℃避光保存。

四．电泳工作液：1.1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷）称取18.171g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。

4℃保存。

可致癌，不要直接接触皮肤。

2.1.0mol/L Tris-HCl缓冲液：称取12.114g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。

4℃保存。

可致癌，不要直接接触皮肤。

3.0.5mol/L Tris-HCl缓冲液：称取6.057g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。

4℃保存。

可致癌，不要直接接触皮肤。

4.10% APS：(一周内使用，最好新鲜配置)称取0.5g APS粉末，加入双蒸水至5 mL，充分溶解，4℃保存。

5.10% SDS:秤取10g SDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用混匀后在室温下静置15min，然后加入5ul TEMED即为分离胶，即可灌胶。

6. 4%浓缩胶（上层胶）：0.7mL 30% Acr/Bis；1.5mL 0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)；60μL 10% SDS；3.6mL双蒸水混匀后加入50μL 10% APS和5μL TEMED（灌胶时再加）。

7.1×电泳液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：3.04 g Tris粉末，14.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1g SDS粉末溶于800ml双蒸O定容至1000ml，室温保存。

可重复使用3-5次。

水中，调PH=8.3，用ddH210×电泳液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：30.4 g Tris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10g SDS粉末溶于800ml双蒸O定容至1000ml，室温保存。

水中，调PH=8.3（浓HCl调），用ddH2五．转膜工作液：1×转膜液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：3.0 g Tris粉末，14.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddHO定容至1000ml，溶解后室温保存，使用时再加250mL甲醇(AR)可重复2使用3-5次。

10×转膜液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：30.0 g Tris粉末，141g甘氨酸（Gl ycine）粉末，12.5g SDS粉末溶于800ml双蒸O定容至1000ml，溶解后室温保存。

使用时稀释10倍，加入20%甲醇。

水中，用ddH2可取10×溶液100ml, ddH2O 900ml，甲醇250ml。

（重复利用再重新加入甲醇50ml）六．封闭液1g脱脂奶粉于20mL 1X TBST混匀,4℃保存。

保存时间不能太久，有味道就不能用了。

七．抗体孵育用液1X TBST缓冲液（使用液）：O 24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2定容至1000ml调节pH至7.4。

室温保存。

10X TBST缓冲液（储存液）：O 24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2定容至1000ml调节pH至7.4。

室温保存。

八．丽春红染液（可回收利用）九．显影液Western Lightning ECL Pro十．STRIP膜再生试剂 100ml 5ml 8ml 12ml 14ml10% SDS 20ml 1ml 1.6ml 2.4ml 2.8ml0.5M Tris HCl （pH6.8） 12.5ml 0.625ml 1ml 1.5ml 1.75ml0 67.5ml 3.375ml 5.4ml 8.1ml 9.45mlddH2β- mercaptoethanol 0.8ml 40ul 64ul 96ul 112ul操作步骤：（一）蛋白样品制备（1）待测蛋白细胞收集1.准备冰盒，提前准备好需要的试剂和器材，EP管：标记好相关信息（细胞名称，蛋白提取，转染信息，时间）；离心管，滴管，含血清的培养液，胰蛋白酶，PBS。

4℃离心机提前预冷；2.弃掉皿内的无血清培养液（含血清的培养液，可直接收到相应的离心管），用1.0ml的PBS清洗，将PBS收到相应的离心管内，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白酶进行消化，37℃，5min。

3.消化后将皿放在冰盒上，冰上操作。

用培养液（可以用离心管内带血清的培养液）吹打细胞，收入离心管（可再冲洗一次，冲洗干净），将离心管配平后放1500r/5min离心。

4.取出离心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固体），管底留少量液体，用手弹离心管底部，震荡离心管，加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管，在离心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。

EP管配平后4℃，1500r/5min。

5.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，弹几下EP管进行震荡，加入1.5ml的PBS涡旋3-5次，配平后4℃，1500r/5min。

6.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，配平状态在4℃离心机进行离心，转速为最高转速14800转，达到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液体。

7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。

（2）细胞总蛋白的提取：1.准备相应的试剂和器材，按照配方配置裂解液和 PMSF溶液，4℃离心机提前开机预冷，准备冰盒。

2.取出收集好的蛋白样品置于冰上。

3．按照配方配置裂解工作液，（根据试剂盒实际要求）摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合），取40-50ul（细胞多用50ul）裂解工作液加入细胞EP管中，吹打均匀，涡旋几次，冰上裂解30min,（裂解期间每10min涡旋一次），裂解完成后再涡旋一次然后转移至4℃离心机14800r/20min（提前开离心机预冷）。

取出离心后的EP管吸取上清，置于新的EP管中。

4. 将轻微离心后的上清可分装后放于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定1.配置10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl溶于10ml去离子水中），用于配置相应的BSA梯度溶液。

2.将标准样品和蛋白样品按下表稀释和加样检测范围=(20-2000ug/ml)工作液最后加，加工作业速度要快，且在冰上操作。

样品：工作液=1：8（25ul:200ul）3.BCA A:BCA B=50:1,每孔需要200ul工作液。

根据需要的数量配置工作液，所需工作液的总体积为：(标准品的个数 + 待测蛋白质样品的个数)×( 实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积) =所需的工作液（当试剂 B 加入到试剂 A 中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。

工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天）注：如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品10ul（样品与工作液的比例为1:20）。

然而，在这种情况下，定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。

A B C D E F G H I4. 将微孔板密封，在 37℃恒温箱30转中孵育30分钟。

（孵育时盖报纸避光）5. 将微孔板冷却到室温。

使用微孔板读数仪，测量样品在 562nm 或该波长附近的吸光值。

打开酶标仪“Gen5 CHS 2.04”图标→新建记录→检测，吸收光→波长562→打开96孔板盖子放入机器开始检测，将结果复制到Excel 中拷贝。

该方法在波长 540-590nm 范围内均可成功得到结果。

由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。

如果想要得到较高的562nm 处的吸光值，则需将孵育时间增加到2 小时。