实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。

3．初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。

细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。

因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。

为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。

原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。

三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。

上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9×l04 Pa（15磅）灭菌30 min，备用。

此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板以及包装灭菌的工作服、口罩和帽子等。

2．试剂（详见附录）：①平衡盐液：Hank’s液；②细胞消化液：常用的有0.25 %的胰蛋白酶（活性1∶250）；③ 0.5 %水解乳白蛋白－Hank’s液（简称Hanks 液）；④小牛血清；⑤ 7.4 % NaHCO3；⑥1 000 u/ml青霉素、链霉素液。

以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。

3．材料：出生后2～3 d的乳鼠。

四、方法与步骤（一）乳鼠肝细胞原代培养的基本过程1．消化法（以胰蛋白酶液消化为例）（1）手的清洗与消毒操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在适合的位置，然后配制营养液及调节平衡盐液的pH值。

1）乳鼠肝细胞营养液的配制0.5 % LH液90 %小牛血清10 %1万u/ml青霉素、链霉素加至约100 u/ml7.4 % NaHCO3调pH至6.8～7.02）平衡盐液-Hank’s液的调节用7.4 % NaHCO3调Hank’s的pH至6.8～7.0（2）处死动物取乳鼠，拉颈椎处死，然后用75 %酒精浸泡2～3 s（注意小鼠在酒精中不宜过长，以免酒精从口和肛门中侵入，影响组织生长）。

（3）取肝用碘酒和酒精消毒腹部，用眼科小剪子剪开腹部皮肤后，暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织，更换剪子和镊子，打开腹腔，即可见到肝脏。

剪1 cm2肝组织，放在无菌的培养皿中。

（4）剪肝用Hank’s液洗涤3次，并剔除脂肪结缔组织、血液等杂物。

将干净的肝组织块移到装有青霉素的小瓶中，用弯头剪把肝组织剪成1 mm3大小的碎块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank’s液洗2～3次，直到液体澄清为止。

图18-1 消化法原代培养基本步骤（5）消化及分散组织块将上步清洗过的Hank’s液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25 %的胰蛋白酶液（pH为7.6～7.8）。

置于37℃水浴中进行消化。

消化时间在20～40 min 左右（消化时间的长短与多种因素有关，如胰蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄、组织块的大小等等）。

每隔10 min摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变白色为止。

这时可从水浴中取出青毒素瓶，吸去胰蛋白酶液。

此时再用Hank’s液洗涤2～3次。

然后，加入少量Hank’s液，用吸管反复吹打织织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。

此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。

（6）计数与稀释从上步滤过的细胞悬液中吸取1 ml细胞液，进行计数。

将细胞液滴于血细胞计数板上，按自细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般以每ml含细胞30～50万为宜。

（7）分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5 ml/小方瓶），盖紧瓶塞。

在培养瓶的上面做好标志，注明细胞、组别及日期。

然后轻轻摇动，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。

最后将培养瓶置于CO2培养箱，37 ℃条件下进行培养。

2．组织块法（1）其他步骤同以上1～3，然后将肝组织移人一新的培养皿中，用吸管吸取0.5 ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成1 mm3左右的小块。

（2）用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。

（3）并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0.5 cm左右，25 ml培养瓶放置15～20块。

（4）吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

（5）轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。

（6）24 h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。

（二）原代培养细胞的观察置于37 ℃培养的细胞，需逐日进行观察。

1．组织块法培养细胞的观察培养24 h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48 h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。

靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。

2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。

24 h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多有形上皮性细胞特征。

48 h以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。

96 h以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。

观察时注意：（1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好，可能是瓶塞未盖紧或营养液pH值过高。

（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。

经过1～2 d培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。

换液时也要注意无菌操作在酒精灯旁倒去原培养瓶中的营养液，再加入等体积新配营养液，pH 7.0。

若经2～3 d后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。

如果希望细胞长得更好些，此时也可换液。

换液时，所用的溶液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清量为5 %。

以后，每隔3～4 d（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。

待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。

（三）培养细胞生长期的划分大多数二倍体细胞在培养过程中维持有限的生存期，最多生存一年左右，传30～50代，相当于150～300个细胞周期。

在全生存过程中，大致经历以下三个阶段：1．原代培养期从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1～4 w。

此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

原代培养细胞与体内原组织相似性大，细胞是异质的（heterogeneous），相互依存性强，细胞克隆形成率很低，与体内细胞性状相似，是药物测试很好的对象。

2．传代期在全生命期中持续时间最长，在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型。

为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期冻存。

目前世界上常用细胞系均在不出10代内冻存。

如不冻存，则需反复传代，这样有可能失掉二倍体性质。

当传30～50代后，细胞增殖缓慢以至完全停止。

3．衰退期细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。

在细胞生命期中，少数情况下在以上三期任何一期均可发生细胞自发转化。

转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系（株）。

连续细胞系的形成主要发生在传代期。

转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（immortality）而无恶性。

所有体外培养细胞包括原代培养和各种细胞系（株），生长达到一定的密度后都需做传代处理。

传代的频率和间隔与接种细胞数量、细胞生物学性质以及营养液性质等有关。

接种细胞多则细胞数饱和速度快；连续细胞系和肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快；培养液中血清含量多时，细胞增殖快。

一般是在细胞长满瓶壁，培养液pH稍降低时做分离培养。

依据细胞特性，将一瓶细胞1∶4或1∶3（即1瓶传4瓶或3瓶）传代。

如NIH3T3成纤维细胞，每3 d传代，接种3×105个/ml。

在细胞长满瓶壁后应尽早传代。

否则细胞会中毒，形态发生改变，重则从壁上脱落死亡。

传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下代细胞的机能状态，细胞需要再传一两代把不健康的细胞除去，才能恢复使用。

注意事项：在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。

为此，在操作前要认真地洗手并用75 %乙醇消毒。

操作前20～30 min即将超净台打开吹风。

操作时，严禁说话，严禁用手去拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳，镊子等去拿。

要在超净台内才能打开培养瓶瓶塞，打开之前要用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。

操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。

使用的吸管在从消毒筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再吸取液体。

总之，在整个无菌操作过程中，都应该在酒精灯的周围进行。

五、作业与思考题1．简述细胞原代培养的操作程序及注意事项。

2．细胞培养获得成功的关键要素是什么？。