选修1《生物技术实践》第一部分微生物的利用实验 1 大肠杆菌的培养和分离一、大肠杆菌1．大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，为兼性厌氧的肠道杆菌。

2．用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。

二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。

分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

本实验用LB液体培养基（通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌，培养后用LB固体平面培养基进行划线分离。

三、细菌的培养和分离1．细菌的培养：（ 1 ）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min 分裂一次。

（2）培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环来转移带菌的培养物。

2．细菌的分离分离的方法与特点：划线分离法：操作简单。

（接种环）涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。

（玻璃刮刀）四、灭菌操作1．灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染。

2．无菌操作的条件：（1）各种器皿必须是无菌的。

（首要条件）（2）各种培养基必须是无菌的。

“细菌喜荤，霉菌喜素”细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压。

在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。

霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。

在中性偏酸的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。

如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力(90 C以上)灭菌30min.3．灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。

( 1)灼烧灭菌(2)干热灭菌：160-170 C下加热1-2h。

(3)高压蒸气灭菌：100kPa、121 C (1kg/cm 2)下维持15min.(4)过滤灭菌：G6玻璃砂漏斗过滤(用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解)4．消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物(包括芽胞、孢子)的方法(1)煮沸消毒法：100 C煮沸5-6min(2)巴氏消毒法：70-75 C下煮30min或80 C 下煮15min(3)化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒; 氯气消毒水源( 4) 紫外线消毒五、大肠杆菌的培养和分离实验1 ．实验步骤：(1)培养基灭菌：将50mlLB液体培养基、50mlLB固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好进行高压蒸汽灭菌。

(封口膜的作用是既通气又不使菌进入)(2)倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开紫外灯和过滤风(3)接种：接种环接种，在37C振荡培养12h( 4)划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在37 C恒温培养箱中培养12-24h ，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。

(5)菌种保存：用接种环取出单菌落，用划线法接种在斜面上，37 C培养24h后，置于4 C冰箱中保存实验2分离以尿素为氮源的微生物、脲和脲酶1•脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。

2•脲酶：有些细菌可以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶(1 )可降解尿素的酶(2)作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成N H,致使pH升高，使酚红指示剂变红。

(NftX 二0 + HO —2NH5+ Oh二、实验设计及步骤1 •实验中的对照设置：实验组：以全营养LB固体培养基进行培养(蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水)对照组：以尿素固体培养基进行培养(葡萄糖，氯化钠，KHPO,酚红，琼脂糖，水)加入通过G6玻璃漏斗过滤(使之无菌)的10ml尿素溶液(内含2g脲)2. 实验步骤：(1)制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。

(2)制备细胞悬液：用1g 土样配制不同浓度的细胞悬液(加无菌水稀释)。

(3)用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酉精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭。

在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。

(4)培养：倒置培养皿，在37 C恒温培养箱中培养24-48h(5)观察：培养基中的菌落数。

实验4果汁中的果胶和果胶酶、果胶1 •化学组成：半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯2 •作用：（1）植物细胞壁的主要成分（2）将植物细胞粘合在一起（去掉果胶植物组织变得松散）3 •鉴别方法：果胶不溶于酒精二、果胶酶1. 来源：黑曲霉、苹果青霉等微生物2.作用：巣胶萌（里胶甲酯塘）果胶------------ > 半乳糖酵酸+半乳糖醛酸甲酯3. 应用:（1）应用原理：水解果胶，使水果组织的分散性加大。

（2）果汁生产：提高出汁率和澄清度。

三、探究制作果汁的最佳条件实验流程:95%的乙醇用于检验是否有果胶如果有浑浊（或者沉淀），说明果胶还没有被完全水解。

如果澄清，说明果胶被完全水解实验6 a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测、酶1功能：是生物体内各种化学反应的催化剂2. 特性：专一性和高效性3•应用的特点：在水溶液中很不稳定，且不利于工业化使用。

二、固定化酶1. 概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

2•酶固定化的方法：吸附法、共价偶连法、交联法、包埋法等。

将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。

三、a -淀粉酶的固定化1. 固定化原理：利用吸附法将a -淀粉酶固定在石英砂上。

一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成淀粉口空糊精满碘靠蕭低谴碓显红色这里使用的是枯草杆菌的 a -淀粉酶，其作用的最适温度为50~75C ;最适PH为5.5~7.52•固定化过程:(1)在烧杯中将5mg a -淀粉酶溶于4ml蒸馏水中(由于酶不纯，可能有些不溶物) 。

(2)再加入5g石英砂，不时搅拌(3)30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)(4)用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶，流速为1ml/min3. 步骤:(1) 淀粉溶液流经固定化酶柱：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上，用滴管滴加淀粉溶液，使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱。

(2) 接取流出物：在流出5ml后接收0.5ml流出液。

(3) 流出物的鉴定：加入1~2滴KI-I 2溶液,观察颜色.用水稀释1倍后再观察颜色。

(4) 洗涤、保存固定化酶柱：用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4C 冰箱中保存。

(5) 几天后取出冰箱中该固定化酶柱，再重复上述实验，看是否有相同的结果。

(可重复使用) 控制流速的目的是使淀粉溶液与淀粉酶充分接触。

洗涤固定化酶柱的目的是洗去残留的反应物和产物。

实验8果酒及果醋的制作一、用葡萄制作葡萄酒1实验原理：(1 )与制作葡萄酒有关的微生物：酵母菌(2)制作葡萄酒所需原料：葡萄(3)制作原理：酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵C6H2Q —2G^ 2 + 2C 2H5OH(4)当培养液中乙醇的浓度超过16%寸，酵母菌会死亡。

2. 实验步骤：(1)冲洗：洗净成熟葡萄，并在高锰酸钾溶液中浸泡，然后用水洗净。

(2)榨汁：用榨汁机以低速将葡萄打成浆状(3)制作酵母悬液：干酵母加水制成糊状，加少许(一小撮)蔗糖，混匀，放置片刻，至酵母悬液中出现气泡。

(4)装入发酵瓶：将葡萄浆放入发酵瓶中，装量不要超过 2 / 3,然后加入酵母悬液，搅拌均匀，瓶上加软木塞或橡胶塞，塞上带有弯曲玻璃管(加水，防止Q进入，空气中杂菌污染)。

(5)酒精发酵：在25-30 oC条件下放置2-3天，若温度偏低，则发酵时间延长；若温度高于30o C,要采取降温措施，否则酒的风味不佳。

(6)过滤、分装、保存：用两层纱布过滤发酵液，除去葡萄皮和籽。

同时可以用洗干净的手挤压滤渣，以获得尽可能多的葡萄酒，分装到1-2L细口瓶中，加盖密封，静置。

待沉淀后，上清液即为葡萄酒。

用这种简单工艺制造的葡萄酒，常温下可保存1-2年。

二、用果汁制作果酒1•制作果酒材料(1) 苹果(最好)、梨、柑橘或其他水果(2) 新鲜酵母或干酵母2. 实验步骤:（1）制取果汁：苹果切成大块，放在多功能榨汁机打碎，用两层纱布过滤果汁（2）配料（以1L为例）:向2L发酵瓶中加200g蔗糖，然后倒入果汁，转动发酵瓶使蔗糖完全溶解，最后倒入酵母悬液（约1g干酵母），混匀，加盖。

（3）发酵：3天后可见气泡，10天后剧烈的发酵停止，此时即可取出果酒过滤和分装。

（4）静置：静置5-6个月，上清液即为果酒，可用虹吸法取出三、用果酒制作果醋实验原理：（1）与制作果醋有关的微生物：醋化醋杆菌如能获得醋化醋杆菌的菌种，可在下列液体培养基中培养繁殖，配方：1L中含蛋白胨3g,酵母提取物5g，甘露醇25g（2）制作原理：醋杆菌在有氧的条件下才能将乙醇氧化为醋酸。

醋杆菌所产生的醋酸可使培养液中醋酸的含量高达13%C2H5OH + O 2 -GH——* 3COOH + H 2O2.实验步骤：（1 ）连接发酵装置：在装置的甲瓶中加入800mL酒一水混合物（用铝箔将上口盖住）。

装盒的乙瓶（发酵瓶）中装入锯末（八分满），下口用双孔橡胶塞连接发酵瓶和外界空气及锥形瓶（丙瓶）。

（2）加入醋化醋杆菌：将适量醋化醋杆菌的培养物加在200mL酒一水混合物中混匀，并将pH调至7.0后倒入乙瓶中，使锯末均匀湿透。

（3）发酵并检测pH :将水族箱通气泵的出气管与乙瓶上塞棉花的玻璃管相连，通气.不必太快，发酵48h,检测PH,若明显酸性，则进入下一步.（4 ）调节活塞，控制流量：调节甲瓶下口的双通活塞和乙瓶下口的螺旋夹，保持液体流量相同。

（5）检测pH,监控发酵情况：每天用pH试纸检测流出液的pH,直至pH不在减少，或者甲瓶中的液体全部流入乙瓶时，停止实验。

实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定一、泡菜腌制1．有关微生物：泡菜制作时起主要作用的微生物是假丝酵母和乳酸菌。

2．泡菜制作原理：在无氧的条件下，微生物利用菜种的糖和其他营养物质进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质，其中也有亚硝酸（HNO2）。

3．泡菜制作流程：（1）预处理：将菜洗净并切成小块，洗净泡菜坛，并加热水洗内壁。

（2）加料入坛：将蔬菜、盐水、糖、白酒、调味品等放入坛内。

如果希望发酵快些，可以将蔬菜在开水中浸1min 后入坛，再加一些白酒（抑制杂菌生长）。

（3）密封发酵：将坛口用水封好（防止外界空气进入），腌制 1 周。

（加入泡菜汁更好，相当于接种已经扩增的发酵菌，减少腌制时间）（ 4 ）成品。