激光共聚焦显微镜在生 物医学研究中的应用
上海交通大学医学院 郭强苏副主任技师
激光扫描共聚焦显微镜
• 激光扫描共聚焦显微镜是80年代逐渐得到广泛应 用，比较先进的细胞生物学分析仪器
• 用激光扫描装置，通过计算机控制和处理获得细 胞和组织内部微细结构的荧光图像
• 观察细胞形态和细胞器及细胞内各种成分的细微 变化，并可动态的检测胞内Ca2+、PH值、膜电位 等生理信号
光活化 Photoactivation
解笼锁 Uncaging
激光扫描共聚焦显微镜在医学 中的应用举例
激光扫描共聚焦显微镜在细胞 凋亡中应用
• 激光扫描共聚焦显微镜不但可用于凋亡细胞亚细胞水平的观察，还可 以观察到细胞内某些超微结构的变化，在培养的K562细胞中加入放 线菌素诱导细胞凋亡，并对细胞内DNA片断进行3‘--末端标记，经观察 发现该细胞凋亡早期有大量DNA片断出现
大鼠附睾组织（AO)染色
动脉内皮细胞三标记染色
培养细胞的免疫组化
细胞内离子和膜电位的实时 定量测定
利用多种特异的荧光探针,激光扫描共聚 焦显微镜可对细胞内各种离子（Ca2+、 K+、Na+、Mg2+）的浓度和膜电位及 PH值动态变化作毫秒级的实时定量检测 和分析，因此激光扫描共聚焦显微镜能 完成对活细胞生理信号的动态检测
激光扫描共聚焦显微镜种类
1、台阶式激光扫描共聚焦显微镜 2、狭缝式激光扫描共聚焦显微镜 3、光束式激光扫描共聚焦显微镜 4、双光子和多光子激光扫描共聚
焦显微镜
激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 原 理
激光扫描共聚焦显微镜的组成
低噪音光电倍增 管
共焦针 孔
激光
发射滤光 片
分光 镜
X-y 扫描装置
急性分离心肌细胞在KCL作用下的胞内钙的变化
光漂白后的荧光恢复 FRAP(Fluorescence recovery After Photbleaching)
FRAP
• 细胞间通讯 • 细胞内的物质的动态变化
光漂白中的荧光损失 Fluorescence Loss in Photbleaching（FLIP）
同步
焦 距
图像贮存 扫描控制
视频显示 三维重建 图像输出
Z轴方向步进电 机
x-y 光门 共焦针孔 PMT增益 滤光片轮
激光共聚焦显微镜与普通荧光显 微镜的差别
1、光源
普通荧光显微镜 汞灯、卤素灯及其他普通光源 激光共聚焦显微镜 激光（能量大、单色性好） 2、光路 激光共聚焦显微镜 共轭光路（能抑制杂散信号） 3、成像
激光扫描共聚焦显微镜有多个荧光通道和一个 透射通道，可对荧光双标记或多标记的细胞和 组织进行测试，同时还可以将荧光图像与像差 图像重叠以显示荧光在形态结构上精确定位。 激光扫描共聚焦显微镜也非常适用于高灵敏度 的快速免疫荧光检测如荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization FISH)
激光扫描共聚焦显微镜的发展
激光共聚焦显微镜是经过几十年的不断改进才逐渐发展起来 的
1957年马文闵斯基（Marvin Minsky)在美国首先阐明了共聚 焦显微镜基本原理，提出了“共轭光路”
1967年埃格尔（Egger)和佩特兰(Patran)成功用共聚焦显微 镜产生了一个光学横断面
1979范德威欧瑞特（Vaader Voort)全面地描述了激光扫描共 聚焦显微镜=标准消像差和色差光学透镜+高灵敏度探测器 +产生特定波长的功率较大的激光器+高速度大容量的微机 系统+精密的扫描装置
COS细胞基因表达与鬼笔环肽共定位
大鼠卵细胞的细胞骨架
三维图像重建
激光扫描共聚焦显微镜通过逐层光学切 片功能，可获得标本真正意义上的三维 数据，经过计算机图像处理软件及三维 重建软件获得标本的三维立体结构，从 而能灵活、直观地进行形态学观察，并 揭示细胞结构的空间关系，测量细胞结 构间的空间距离
ZEISS510激光共聚焦显微镜系 统的简介
三根激光管、五个波长(351\364\458\488\543nm) 三个荧光通道+一个透射通道 可调控恒温平台 高压汞灯 像差 微分干涉 2.5、5、10、20、40、63、100倍大数值孔径 物镜， 20、40长工作焦距物镜 数字胶片打印机、彩色喷墨打印机、光盘刻入机
激光扫描共聚焦显微镜 功能概述
组织光学切片 “细胞CT”
共聚焦成像光路的共轭的原理，可有效抑制同 一焦平面上的非测量点的杂散荧光及非焦平面 上的荧光，因此具有深度识别能力（最大深度 200--400um)，可以逐层获得高分辨率的光学 横断面图像，从而对细胞和组织进行无损伤的 系列光学切片（Optical sectioning)
消色差——激光共聚焦显微镜图象很多是 应用不同的波长多通道扫描
温度矫正—激光共聚焦显微镜可以进行活 细胞的动态观察，需调整温度
什么是球差？
一个理想的物镜
实际的球镜
弥散斑
球差
பைடு நூலகம்
无球差时
有球差时
影响显微镜成像质量的因素
• 物镜（已知的） • 浸润的介质(不定的)
不同的介质有不同的折光率，如在23度时物镜油 的折光率是1.515左右 • 盖玻片(不定的) 玻璃的的折光率是1.5, 但盖玻片的厚度有变化, 因 此要求其厚度控制在0.17mm • 标本(不定的) 标本的景深有变化, 其光密度不均匀, 活细胞的折光 率从1.33--1.38不等
细胞结构和细胞器测定
激光扫描共聚焦显微镜可进行低光测试、 重复性极佳，能进行细胞和组织的荧光 定量分析，从而能对单细胞或细胞群的 溶酶体、线粒体、内质网、纺锤体、细 胞骨架、结构性蛋白、DNA、RNA、酶 和受体进行定性定量测定
动脉内皮细胞三标记染色
细胞的有丝分裂（示纺锤体）
荧光的定量定位分析
普通荧光显微镜 照相机、CCD 真彩 激光共聚焦显微镜 PMT（光电倍增管） 伪彩
激光与汞灯的差别
激光
汞灯
单色性好、能量大
激发波长范围广
XYZ轴有很高的分辨率 无Z轴分辨率
须选择与激光波长匹配 荧光探针选择范围广 的荧光探针
激光共聚焦显微镜对物镜的要求
消球差——激光共聚焦显微镜图象要求在Z 轴没有偏差