五聚赖氨酸β-羰基酞菁锌：光动力疗法中一种有效的肿瘤靶向光敏剂介绍作为一种潜在的抗癌方法，光动力学疗法正日益受到人们的关注。

在各种光敏剂中，酞菁由于它优越光敏特点而被广泛的研究：在670nm处的强吸收（此处光的组织穿透深度是卟吩姆钠630nm处的两倍)，选择性地被肿瘤细胞摄取，具有低毒性，高化学和光化学稳定性的特点。

然而，未被取代的酞菁是疏水的，在体液中难溶。

在一些实验研究中发现，大部分的两亲性光敏剂比相同类型的疏水或亲水分子具有更高的光学动力。

酞菁外周的磺基取代是个很好的方法增加酞菁的水溶性，因而它们更适合在生理系统中使用，CAUCHON等人发现将酞菁用三个磺酸集团和一个疏水的乙炔基取代大大增加了细胞摄取，优先定位在线粒体膜，对emt-6L老鼠乳腺的肿瘤细胞产生光学动力效应。

邻二磺酸酞菁比对二磺酸酞菁有更好的活性。

他们在培养的细胞和实验动物的肿瘤细胞中可以有效的穿透细胞并显示出高效的光动力学效应。

新近的研究表明ZnPc-S2P2可在体外有效杀灭肿瘤细胞，而体内使肿瘤凋亡。

此种两性光敏剂的临床一期实验正在进行。

另一种二磺酸盐衍生物，AlPcS2，也证实主要通过杀灭肿瘤细胞而非损害血管来引起肿瘤衰亡。

在光敏剂中引入正电荷取代基不仅可增加酞菁环的极性和溶解性，还可以增加细胞摄取并提高对肿瘤细胞及细胞内位点的靶向性。

观察发现，阳离子吡啶酞菁锌比阴离子及中性酞菁锌有更强的细菌光毒性。

另外，研究还发现，N-甲基吡啶氧基酞菁和多聚L-精氨酸氯e6？可使革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌失活。

将取代酞菁纯化为单一异构体面临着很大困难。

非对称性取代酞菁则由于存在多种异构体难度更大。

我们开发了一种可实现大规模制备单取代β-羰基酞菁锌的合成与纯化方案。

在此化合物的基础上，我们合成了一非对称酞菁锌共轭体系，ZnPc-(Lys)5。

该共轭化合物的定量细胞摄取及光毒性都与ZnPc-S2P2及ZnPc-S4做了比较。

光动力活性评估方面，体外引入三种细胞株（人源胃癌细胞，人源慢性髓性白血病细胞及人胚肺成纤维细胞），而体内实验对象为昆明鼠皮下植入的S180肿瘤。

我们还进行了该多聚赖氨酸酞菁锌的药代动力学及生物分布方面的研究。

我们的研究表明，ZnPc-(Lys)5在体内外具有优良的光动力学效应。

这表明ZnPc-(Lys)5可能成为一个有价值的临床前研究的候选药物。

结果和讨论在癌症的光动力疗法中，酞菁是一种强效的光敏剂。

人们也常解析酞菁衍生物的水溶性及肿瘤靶向性等生物学性质。

尽管如此，取代酞菁，尤其是非对称取代物的大规模纯化为单一异构体始终有不小的挑战。

我们认为ZnPc-(Lys)5为高纯度，水溶性的酞菁锌光敏剂。

由于，肿瘤细胞比正常细胞有着更多的净负电荷，因此光敏剂中荷正电的五聚赖氨酸基团可具备肿瘤靶向性。

此外，由于内吞作用，细胞对带正电荷的物质（尤其大分子量物质）有着比中性或负电荷分子更大的摄取量。

ZnPc-(Lys)5的性质ZnPc-(Lys)5大量制备，通过反相高效液相色谱纯化（图1），纯度为99%。

通过核磁共振及质谱对ZnPc-(Lys)5的结构进行了确认(calculated for C63H76N18O7Zn m/z: 1262.80,found: 1263.9)。

在DMSO中，ZnPc-(Lys)5的紫外可见吸收图谱对于ZnPc是典型的，最大吸收峰位于678 nm (e=118380 Lmol1cm1)。

在DMSO中，ZnPc-(Lys)5的单线态氧的量子产率为0.64，这与ZnPc的0.67相似，这表明五聚赖氨酸基团并未严重改变单线态氧的产生。

光敏剂的细胞摄取ZnPc-(Lys)5及其他两种阴离子ZnPcs的细胞摄取皆为剂量依赖性，即ZnPc浓度越高，细胞摄取越多（图2）。

在三种细胞株（BGC-823, K562, and HELF）中，ZnPc-(Lys)5比其他两种阴离子ZnPcs的细胞摄取高出许多。

这有可能是五聚赖氨酸带正电荷之故。

另外，在2小时的培养时间内，肿瘤细胞（BGC-823,图2a;K562的摄取曲线与BGC-823相似）对ZnPc-(Lys)5的摄取显著高于正常细胞（HELF,图2b）。

五聚赖氨酸的细胞摄取增多与带正电荷的ZnPc-(Lys)5和因过度表达多聚唾液酸残留物而带负电的肿瘤细胞表面之间的离子作用有关。

光敏剂的亚细胞定位图2c表明在经过2个小时的培养后，ZnPc-(Lys)5进入K562细胞内部。

而对于阴离子的ZnPc-S2P2及ZnPc-S4,此时段细胞内部并未积聚。

这些发现与上文讨论的ZnPc-(Lys)5的细胞摄取量更高相符。

光敏剂的亚细胞定位有过很多报道，研究发现，这与光敏剂及多肽或配体的性质均有关系。

Lo等人报道经过2小时培养后，1,3-二甲氨基-2-丙氧基取代ZnPc定位于人HT29大肠癌细胞膜。

然而，经过24小时培养后，对称阳离子，中央Si原子被两个基团取代的3 - 吡啶氧基硅酞菁优先定位至人HEp2细胞溶酶体。

一系列带阳离子的酞菁-多肽共聚物优先定位溶酶体。

一些PEG取代的卟啉衍生物及一些阳离子卟啉亦可定位溶酶体。

阴离子，如磺酸或羧酸盐取代的光敏剂优先定位溶酶体，而光照后则定位细胞核。

而阳离子取代的亲脂性光敏剂则可穿过线粒体膜并在线粒体内部积聚。

线粒体这一亚细胞器是细胞凋亡的关键组件，是PDT中细胞死亡的通路。

这些多种研究结果提示对于亚细胞定位，细胞摄取动力学，以及酞菁光敏剂之间关系的进一步研究十分必要。

酞菁锌的光毒性及暗毒性在K562细胞的2小时培养中（图3a），比起ZnPc-S2P2或ZnPc-S4，ZnPc-(Lys)5都剂量依赖地呈现出更强的光毒性，这与其更高的细胞摄取一致。

在K562细胞中，ZnPc-(Lys)5的IC50为10μm，而ZnPc-S2P2则>30um。

光毒性与培养时间紧密相关。

图3b显示，如增加为24小时，ZnPc-(Lys)5与ZnPc-S2P2的IC50分别降至0.2um和4.3um。

而对于阴离子的ZnPc-S4，光毒性微乎其微，且增加培养时间并不提高对K562的光毒性：图3b显示，2小时及24小时两种不同的培养时间下IC50值无异。

BGC-823也观察到了类似的结果。

我们也考察了这些光敏剂对于成纤维细胞株（HELF）的光毒性。

与肿瘤细胞（K562，图3c）相较，ZnPc-(Lys)5对HELF的毒性小得多。

ZnPc-(Lys)5对HELF细胞的IC50至少比对肿瘤细胞K562的IC50高5倍。

这可能与HELF细胞对ZnPc-(Lys)5的摄取比肿瘤细胞低有关。

值得关注的是，ZnPc-S2P2尽管细胞摄取量低于ZnPc-(Lys)5，其对肿瘤细胞和正常细胞的光毒效应选择性仍相近。

这提示这两种酞菁锌的光动力效应之下有着不同的机制或是不同的细胞定位。

而对于ZnPc-S4，即便经过24小时培养（图3c），小剂量(1.5 J cm_2)下并未发现光毒性。

这与已发表的数值是相符的。

例如，新近表明人SiHa宫颈癌细胞的IC50值为200um。

没有激光的条件下，这些化合物的细胞毒并不显著（图3，右手边），这表明了这些酞菁锌光敏剂有着宽广的安全余地。

总体而言，这些体外细胞实验结果表明带正电荷的ZnPc-(Lys)5比带负电荷的酞菁锌（ZnPc-S2P2或ZnPc-S4）有着更高的光动力学效应。

ZnPc-(Lys)5的生物分布研究研究发现，聚赖氨酸是能够提高光敏剂抗菌活性的有效载体。

但在循环系统中，聚赖氨酸可被胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶降解，此酶特异性针对正电荷物质如精氨酸或赖氨酸。

为了评估该聚赖氨酸的潜在不稳定性，我们测定了ZnPc-(Lys)5的血浆清除率。

对荷瘤鼠静脉给予光敏剂，剂量为2 mgkg_1，采用荧光光谱法对组织及血浆中的光敏剂进行定量。

ZnPc-(Lys)5的血浆清除率常数为1.12 h1，并服从单指数衰减（图4），这与0.6小时的半衰期一致。

另外，研究还测定了ZnPc-(Lys)5的肿瘤及器官浓度。

如图5所示，2 mgkg_1的剂量下，在所有组织标本中，ZnPc-(Lys)5在大脑中的保留是最低的(<500 ngg1)。

这提示了ZnPc-(Lys)5的低神经毒性。

然而，ZnPc-(Lys)5的肾、肺、脾保留很高，注射后30分钟至6-12小时逐步升高，之后下降（图5）。

在整个观察期间皮肤和肌肉对于ZnPc-(Lys)5的保留是较低的。

因此，尽管这个含赖氨酸的光敏剂可在血浆中降解，ZnPc-(Lys)5在小鼠体内还是可以分布至许多组织。

在96小时的观察窗内，ZnPc-(Lys)5的肿瘤/皮肤比值为2:1至4:1。

肿瘤中ZnPc-(Lys)5的持续富集使重复性光动力学疗法成为可能。

据报道，疏水性的光敏剂的肿瘤/正常组织比值可达8:1，而结构相似的亲水性光敏剂比值仅2:1。

我们观察到ZnPc-(Lys)5在肝脏内有更高的保留（图5b）。

在给药96小时后，保留降至峰值的20%。

尽管如此，体外培养人肝细胞实验显示酞菁锌仅在浓度超过30um时肝毒性才会显著，这表明酞菁锌是相对低毒的。

另外，在比格犬上进行的ZnPc-S2P2重复给药毒理学研究显示高达4.5 mgkg 1的剂量并未导致死亡或生理异常，即使在病理组织学检查中一些肝脏区域的浓度在4.5 mgkg 1。

这些结果再次表明了酞菁锌光敏剂的相对低毒性。

S180肿瘤模型上ZnPc-(Lys)5的光动力学疗法研究生长抑制分析是用以评估ZnPc-(Lys)5对昆明鼠移植S180肿瘤的抗癌活性。

所有动物移植的肿瘤标本均收获。

我们使用单因素方差分析来考量治疗组与对照组之间，以及各治疗组之间的肿瘤重量差异。

表格1表明各治疗组，相对于非治疗组，肿瘤的生长受到显著抑制（p<0.01）。

ZnPc-(Lys)5在1mg/kg与2mg/kg剂量下对肿瘤生长抑制相近，这表明在S180肿瘤模型上，ZnPc-(Lys)5在1mg/kg时就已达到最大疗效。

ZnPc-(Lys)5体内实验的相对低剂量也与其高细胞摄取相符。

有趣的是，仅使用激光治疗的荷瘤鼠出现了部分的肿瘤生长抑制效果。

这可能是波长680nm的红光可触发了鼠体的免疫反应，虽然这种低密度激光放射并非一种确立的疗法。

另一方面，给予ZnPc-(Lys)5但不使用激光的治疗组的肿瘤也有部分抑制。

当然，给予ZnPc-(Lys)5且使用激光的治疗组抑制作用最为显著，这确定了ZnPc-(Lys)5为一体内试验有效的光敏剂。

结论我们制备了全新非对称的ZnPc-(Lys)5，该化合物具水溶性，且可大量、高纯度制备。

与阴离子酞菁锌（ZnPc-S4和ZnPc-S2P2）相比，ZnPc-(Lys)5有着更高的细胞摄取以及对肿瘤细胞高出20倍的光毒性。