鸢尾丝囊霉(Aphanomyces iridis)引起的烟草漂浮苗根腐病的初步报道李小杰;李淑君;李成军;胡亚静;康业斌;邱睿;陈奇园;白静科;陈玉国【摘要】To ascertain root rot pathogen, 12 samples were collected from Baofeng, Biyang, Xuchang, Linying of Henan province in May 2017, and were analyzed by pathogenicity test. Morphological characteristics were identifi ed and 18S rDNA-ITS sequence analysis was conducted. A total of 10 fungal isolates were obtained from these samples, and their 18S rDNA-ITS sequences were 99% homologous to Aphanomyces iridis sequence in the NCBI database.Inoculation experiment of floating and potted plants showed that the incidence was 100%, and the same pathogen was also separated from diseased tissue on PDA medium. According to symptom and pathogen, the disease was identified as tobacco seedling root rot in floating bed which was caused by Aphanomyces iridis.This is the first time that Aphanomyces proved to have caused tobacco seedling root rot.%为明确近年来烟草漂浮育苗过程中出现的疑似根腐病的病原,2017年5月分别从河南省宝丰、泌阳、许昌、临颍等烟区苗床共采集12个具有代表性的病害样本,进行病原菌分离、形态学鉴定、18S rDNA-ITS序列分析和致病性测定.结果表明,从样本中分离纯化出10个真菌菌株,其18S rDNA-ITS序列与NCBI数据库中鸢尾丝囊霉(Aphanomyces iridis)序列同源性均为99%.漂浮苗及盆栽接种试验结果表明,烟苗接种后均有不同程度的发病,发病率为100%.将发病组织在PDA培养基上进行分离培养,也同样得到丝囊霉菌.本研究根据发病症状和病原菌,首次明确了鸢尾丝囊霉可引起烟草漂浮苗根腐病.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2018(024)002【总页数】4页(P125-128)【关键词】烟草漂浮育苗;根腐病;病原鉴定;丝囊霉属;致病性【作者】李小杰;李淑君;李成军;胡亚静;康业斌;邱睿;陈奇园;白静科;陈玉国【作者单位】烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南科技大学林学院,河南省洛阳市天津路70号 471000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;河南科技大学林学院,河南省洛阳市天津路70号 471000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000;烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室河南省农业科学院烟草研究所,河南省许昌市魏都区永昌大道与青梅路交叉口 461000【正文语种】中文烟草苗期根茎类病害有猝倒病、立枯病、炭疽病、黑胫病、根黑腐病、镰刀菌根腐病等[1-5]，其中以猝倒病、立枯病、炭疽病发生较为普遍，给烟草苗床管理带来较大危害。
1994年，陈瑞泰[1]报道由镰刀菌引起的烟草苗床根腐病在云南省苗床有发生，是一种具有潜在危害性的病害。
烟草漂浮育苗技术是全国烟区推广普及的一项新型实用育苗技术，对提高烟叶整体生产水平，提高烟叶质量起重要作用。
随着漂浮育苗技术推广面积的扩大及其应用年限的增长，加之苗床管理不规范，近年来烟草漂浮苗根腐病的发生有逐年加重的趋势[6-8]，且病原种类也在不断增加。
据报道，腐霉属中瓜果腐霉［Pythium aphanidermatum ( Eds. ) Fitzp.］、终极腐霉( Pythium ultimum Trow) 和畸雌腐霉( Pythium irregulare Buismand ) 等可引起多种植物的根腐病，其中瓜果腐霉可引起烟草猝倒病[9-10]。
2012年，劳超等[11]首次报道了由异丝腐霉引起烟草漂浮苗根腐病。
李宏光等[12]从漂浮育苗中分离鉴定出5属6种导致烟苗根腐的细菌。
2017年在河南省宝丰、泌阳、许昌、漯河等烟区烟草漂浮育苗过程中，烟苗出现生长缓慢、植株矮小、生长势差、叶色发黄等问题，浮盘下烟苗的根呈灰褐色，后腐烂死亡，发病严重的烟苗茎基部及底部叶片的叶脉出现褐色坏死，给烟苗生产带来了很大的威胁。
为明确病原，同时为苗床病害的防治及苗床管理提供依据，本研究采集了具有代表性的病害样本，并对样本进行了病原菌分离、鉴定以及致病性测定。
1 材料与方法1.1 样品采集2017年5月自平顶山宝丰、驻马店泌阳、许昌县、漯河临颍烟区苗床采集有代表性的疑似根腐病的病害样本共12个，进行病原物分离及鉴定。
1.2 病原菌分离及形态观察采用PDA（马铃薯萄萄糖培养基）常规分离法进行病原菌分离，将洗净的新鲜病根或病茎剪成5 cm长的节段，无菌水浸洗4～5次，置PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养4～6 d，待菌落形成。
切取菌落边缘部分置于新的PDA培养基上进行纯化，获得纯菌株后，转移到PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养7～15 d，显微镜下进行形态学观察。
1.3 病原的分子生物学鉴定使用真菌基因组提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA，用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1/ITS4和18S rDNA引物NS1/NS6进行PCR扩增，其序列分别为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。
引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。
PCR反应体系为25 μL：Taq 酶0.3 μL，10×Buffer （Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各0.5 μL（10 μM），模板1 μL（50 ng/μL），加dd H2O 至25 μL。
PCR反应条件为：94 ℃ 4 min，94℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 个循环，72 ℃延伸10 min。
扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对，选择同源性较高的序列用MEGA软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.4 病原菌回接试验（1）漂浮苗水培接种法：从病组织上获得病菌的纯培养后，置于PDA培养基上，25 ℃恒温光/暗（12 h/12 h）培养12 d，制备孢子悬浮液，调整浓度约为1×106 个/mL。
将中烟100漂浮苗置于孢子悬浮液中，置25 ℃、黑暗/光照为12 h/12 h的人工气候箱中培养，以无菌水做对照。
5～7 d后，观察发病情况。
（2）盆栽灌根接种法：选苗龄为4～5真叶健康的中烟100烟苗，用灭菌的手术刀对根系造成伤口，移栽至直径为10 cm的花盆中，每株灌20 mL孢子悬浮液（浓度同上），以无菌水接种做对照。
5～7 d后，观察发病情况。
2 结果与分析2.1 病原菌分离及形态学观察从采集到的12个疑似根腐病的病害样本中分离纯化获得具有代表性的真菌菌株10个（图1），编号分别为 BF-2、BF-3、BF-4、BF-5、BF-6、BY-1、BY-2、LH-3、LH-5、XC-1。
图1 样品采集照片Fig.1 Photos of sample collection注：A: 漂浮苗整体发病情况；B: 漂浮苗单株发病症状。
Note: A: The overall infection situation of floating seedlings; B:Symptom of disease of the single plant.10个菌株的形态学观察结果表明，菌落生长茂盛，气生菌丝白色棉絮状（图2A），光学显微镜下（400倍），菌丝无色，无隔膜，直径2.5～12.5 μm，平均约8.2μm；孢子囊顶生，由球形膨大菌丝形成，无乳突，直径17.5～32.5 μm，平均约24.1 μm；藏卵器顶生，短柄，球形。
卵孢子球形、透明，具有双层厚壁，直径22.5～32.5 μm，平均约26.4 μm（图2B、C）。
图2 分离菌在PDA培养基上的培养性状及病原形态特征Fig.2 Characteristics and pathogenic morphology of isolated Fungus on PDA medium注：A：菌落特征；B：孢子囊；C：卵孢子（目镜×物镜：10×40倍）。
Note: A: Characteristics of the colony; B: Sporangium; C: oospore.2.2 病原菌的分子生物学鉴定通过Blast，10个菌株ITS区段的比对结果表明（图3），所分离纯化得到的10个菌株与NCBI数据库中鸢尾丝囊霉（Aphanomyces iridis）序列同源性均为99%，且位于同一分支。