根据冠瘿碱不同， Ti plasmids可以为几种： • 1)胭脂碱型（Nopaline plasmids）: 带有 在 植物中合成胭脂碱的基因和在 细菌中代 谢、利用胭脂碱的基因。形成的肿瘤可以 分化出不定芽。 • Nos启动子， Nos终止子。 • 2)章鱼碱（Octopine plasmids）:带有在 植物中合成章鱼碱的基因和在 细菌中代谢、 利用章鱼碱的基因。形成的肿瘤不能分化， 成为愈伤组织。
（4）检测外源基因的转录和表达产物
目的基因表达盒
双元载体系统
多 克 隆 位 点
Hin d III Sph I (11083) Pst I Sal I Xba I Bam H I Sma I (11052) Kpn I Sac I Eco R I Bst XI
L ac Z alph a
tgacaggatatattggcgggtaaac RB tggcaggatatattgtggtgtaaaca LB
大肠杆菌 质粒
农杆菌Ti 质粒
重组农杆 菌Ti质粒
共整合载体
• 2. 植物细胞转化的双元系统 目前T-DNA转化植物细胞的标准方法 是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因 的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的农杆 菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整 合系统所不同的是，含外源基因的质粒可 在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌 侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质 粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA 切割下来，转移到植物细胞中。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界。 左边界（left border）和右边界（right border）：是长为 25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 生长素合成酶基因（tms）：由2个基因组成：tms1 （iaaM） 和tms2（iaaH）； 细胞分裂素合成酶基因tmr：由1个基因组成：ipt 冠瘿碱合成酶基因tmt：冠瘿碱是含稀有氨基酸衍生物，称 为opines，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine） 、胭脂碱 （nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱 （succinamopine）。被感染的植物诱导合成这些有机碱，但 植物不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨 基酸和糖类，供根癌农杆菌作为氮源及碳源使用。
（2）PCR检测植物基因组中外源DNA（目的 基因、启动子）
（可能有假阳性）
（3） Southern blot直接检测植物基因组中外 源DNA（目的基因、启动子）
鉴定转基因最直接的证据。发表文 章时必须提供该证据
基因组DNA、酶切、电泳、转移DNA到 杂交膜、与探针杂交、洗脱、检测（放射 法、化学法）、照相
1.T-DNA 的结构
LB
auxA auxB
cyt
ocs
RB
LB, RB – left and right borders (direct repeat) auxA + auxB – enzymes that produce auxin cyt – enzyme that produces cytokinin Ocs – octopine synthase, produces octopine
Nhe I (5467)
基因
三、农杆菌介导的转基因步骤
1. 农杆菌准备：单菌落、试管中培养，再在三角瓶中放大 培养（1：30-50稀释）至OD600=0.5-1。在培养结束前 1h加20-100μM AS可以促进农杆菌的转化。40005000rpm/4℃离心收集，再用植物培养基悬浮，备用。 植物材料的准备：要求生长健壮、再生能力强、无菌； 切成小片（小段）。 感染：将农杆菌液与植物材料混合，浸润10-30min。 共培养：植物材料在无菌吸水纸上吸干农杆菌液后，转 到共培养基上（共培养基常常含有AS），培养2天，转 基因在此时间内完成。 筛选与再生：共培养结束后的植物材料转到选择与再生 培养基上（含2种抗生素，分别抑制农杆菌和非转基因植 物细胞生长）。 转基因植物的鉴定与评价：报告基因、PCR、Southern blot、Northern blot、产物分析等。
• virA - transports AS into bacterium, activates virG； • virG - promotes transcription of other vir genes； • virD2- endonuclease that cuts T-DNA at the borders but only on one strand; attaches to the 5‘ end of the SS of T-DNA； • virE2- DNA-binding protein, binds SS of TDNA；
二、农杆菌介导的植物转基因方法
植物转基因方法分为两类： 一是直接基因转移方法:基因枪法、 PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、 电激转化法等，其中基因枪转化法是代 表。 二是生物介导的转化方法，主要有农杆 菌介导和病毒介导两种转化方法，其中 农杆菌介导的转化方法操作简便、成本 低、转化率高，广泛应用于双子叶植物 的遗传转化。
植物筛选基因
N OS p o lyA T-BOR D ER (R )
pCAMBIA1305.1
C aMV35S p o lyA
11846 b (L ) kanamycin (R ) p VS1 Sta 启动子
终止子
p BR 322 ori p BR 322 bo m p VS1 rep
植物肿瘤
二、植物基因表达载体
天然的Ti质粒不能作为表达载体使用： a. 被转化的植物细胞产生大量的生长素和细胞分裂素， 导致肿瘤的形成，阻止了细胞再生长为整株植物，因此， 必须除去生长素和分裂素基因。 b. 冠瘿碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影 响植物细胞生长，因为冠瘿碱合成大量消耗精氨酸和谷氨 酸，因此必须去除冠瘿碱合成基因（tmt） c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找 到单一的酶切位点。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒 DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 植物细胞中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒， 发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒 上进行分子重组操作的困难。
2. 3. 4.
5.
6.
感染
转化
选择
再生 图 农杆菌转化植物细胞
转基因植株评价与鉴定
转基因植物的鉴定：
（1）检测报告基因: GUS（编码葡萄糖苷酶）
5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖 苷，无色
兰色
GUS染色原理 报告基因检测（GUS染色）
分析启动子功能
GFP基因
GFP: green fluorescent protein。是从维多利亚水母 (Aequorea victoria)中分离出 来的，受紫外线激发而发出绿 色荧光
1.2 利用固氮菌提高作物产量
•化学固氮
转化条件苛刻：温度高于500℃，压力大于200atm。 大量施入田间的肥料流失，最终流入海洋，导致水体严 重污染以及水中微藻及其它微生物大量繁殖。
•生物固氮
无需消耗燃料或电等能源，不造成污染，过程复杂，需 要酶（固氮酶和固氮酶的还原酶）的参与，消耗大量ATP， 需要严格无氧的微环境。
– virD2 & virE2 also help T-DNA get to nucleus in plant cell, they have NLSs(核定位信号)；
• virB - 11 ORFs, helps DNA-protein complex get through cell membranes。
缺点： 操作比较麻烦、难度大 （原生质体制备、转化、再生）
Protoplast transformation of transgenic Valencia sweet orange plants with GFP by PEG-mediation
一、农杆菌介导的（Agrobacteriummediated ）转基因机理
• 3)农杆碱型（Agropine plasmids）:带有 在 植物中合成农杆碱的基因和在 细菌中代 谢、利用农杆碱的基因。形成的肿瘤不分 化，生长迟缓，死亡早。 • 4) 发根型（Ri plasmids）: 诱导毛状根或 者肿瘤。
2. Vir (virulent) genes（毒性基因区，致 病基因区
植物与微生物的相互作用
一、共生菌与病原菌的应用
1.1利用工程化的共生菌保护植物免受冻害
定植于植物叶面的丁香假单胞菌在细胞表面产生一种冰 成核蛋白（ice nucleation protein），在稍低于0℃以下的条 件下，这种蛋白引起结冰，使作物遭受冻害，Steven Lindow及其研究小组利用DNA重组技术及同源重组技术得到 Ice-突变株，使结冰温度下降到-9 ℃。
（一）Ti质粒的结构
肿瘤区
毒性区 复制区 冠瘿碱代谢区
Ti质粒大约在160-240kb之间。其中TDNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb 左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区 （region encoding conjugation)和ori区 （origin of replication)。
• 1. 植物细胞转化的共整合系统 T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有 E.coli的选择标记和植物选择标记Kan+。首 先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质 粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源 序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质 粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分 子整合到植物细胞染色体DNA上， Kan+筛 选转化细胞。
（二）T-DNA的整合机制
T-DNA的详细整合机制尚不完全清楚，明确的： 农杆菌染色体上的基因（chvA, chvB, pscA等）决定与植物 细胞的附着； 植物损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮， 这些酚类物质可以诱导Ti质粒上Vir（Virulence region)基 因的表达； Vir区编码的基因产物分别在LB和RB的第三个碱基和第四个 碱基之间产生缺口，形成单链T-DNA，并将其运到植物细 胞核中，整合到核基因组中。由特异性内切酶完成。TDNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整 合有关，而LB无关。 T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联 形式排列。