HPLC与GC的H-u曲线见 图3-1： （1）两者曲线形状相 似，都有一个H最小值； （2）HPLC的H最小值比 GC的最小值小一个数量 级以上，柱效更高； （3） HPLC的最佳流速 u比GC的最佳流速u也小 一个数量级以上。
二、柱外展宽：指色谱柱外各种因素引起的峰扩 展. a.柱前展宽：主要由进样所引起；
由于固定相的多孔性能使流动相滞留在其微孔内，微孔内 的流动相称为滞留区流动相（静止状态，不流动）。当流动 相中的试样分子与固定相进行质量交换时，必须先从流动相 扩散进入到滞留区。如果固定相中微孔既小又深，则滞留就 越严重，传质就越慢，对峰扩展影响也越大。
H sm
Cs
m
d
2 p
Dm
u
(3 4)
式中C sm是一常数, 它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的
（溶质分子X与溶剂分子S对吸附剂表面竞争吸附） 3.结论69/-5： 如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的
溶质分子将相应减小。显然，分配系数大的组分， 吸附剂对它的吸附力强，保留值就大. 4.作用：a.适用分离相对分子质量中等油性试样。
b.对具有不同官能团的化合物和异构体有较 高的选择性。 缺点：由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象.
b.两相应互不相溶，有明显的分界面 2.分离机制：试样组分溶于流动相后,在固定相和流动相之
间的相对溶解度存在差异，溶质在两相间进行分配。 • 分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分
保留值大，而且流动相的种类对分配系数有较大的影响.
3.解决固定液流失问题方法： 1）一般为了避免固定液的流失，对于亲水性的固
定液常采用疏水性的流动相，而疏水性的固定 相则采用亲水性的流动相，从而使固定液不至 于由于溶解于流动相而带走流失，即所谓的正 反色谱法。
• 问题：何谓正相色谱及反相色谱？在应用上有 什么特点？
答：在色谱法中，流动相的极性小于固定液的极 性，称为正相色谱；在色谱法中，流动相的极 性大于固定液的极性，称为反相色谱。在应用 上，正相色谱主要用于分离极性物质；反相色 谱主要用于分离弱极性或非极性物质。
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但 沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只 要试样能够制成溶液，即可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性 差、相对分子量大的限制。
§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
与GC 比较65/1；基本概念及理论基础与GC一致； 主要区别：流动相不同.
因此，高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不 需要气化，不受试样挥发性的限制。
•从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液 相色谱的异同点。
解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行 分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度， 克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多， 分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰 检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光 检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。
i.流动的流动相中的传质阻力项Hm 当流动相流经色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒
表面的流速较慢，而流路通道中心的流速则较快，移动 速度不一样从而引起峰形变宽。
Hm
Cmd
2 p
Dm
u
(3 4)
式中Cm是与k
(容量因子）函数。d
固定相的粒度。
m
Dm试样分子在流动相中的扩散系数。u流动相线速度.
ii.滞留的流动相中的传质阻力项Hsm
•液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处?
解:液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为 涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相 传质以及柱外效应。
在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相 色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。 另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流 动相传质及柱外效应。
• 4、要提高液相色谱分离的效率，必须提高柱内填料填装 的均匀性和________以加快传质速率，其中_________ 是提高柱效的最有效途径。
§3.3高效液相色谱的主要类型及其分离原理
类型：液-液色谱；液-固色谱；离子交换色谱；离子对色谱； 离子色谱；空间排阻色谱
一.液-液分配色谱法及化合键合相色谱 1.特点：a.流动相和固定相都是液体
具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对 交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 2.适用范围70/3；凡能在溶剂中电离的物质一般均可用该法 进行分离。离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离 子与流动相中具有相同电荷的溶质离子发生可逆交换反应：
阳离子交换：
M＋＋（NaSO3 树脂） Na＋＋（M O3S 树脂） (3 7)
2）在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶 解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液也会 不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变 坏等不良后果。为了更好地解决固定相从载体上流失的 问题，采用化学键合固定相。
• 问题：何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ • 答：利用化学反应将固定液的有机官能团共价键合在载
化学键合固定相
• 根据在硅胶表面的化学反应不同，键合固定相 可分为：硅氧碳键型（≡Si-O-C)；硅氧硅碳键 型（≡Si-O-Si-C);硅碳键型（≡Si-C)；硅氮键 型（≡Si-N)。
• 硅烷化反应：
二.液-固色谱法（或液-固吸附色谱法） 1.特点：流动相为液体，固定相为吸附剂。 2.分离机制：根据物质吸附作用的不同来进行分离。
练习
• 1、在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（ ）。
• A 减小填料粒度 B 适当升高柱温 C 降低流动相的流 速 D 增大流动相的流速
• 2、高效液相色谱中，可以忽略不计的影响色谱峰扩展的 因素是（ ）。
• A 涡流扩散项 B 纵向扩散项 C 传质阻力项 D 柱 外展宽
• 3、在液相色谱中，纵向扩散项Hd＝B/u较小，通常可以 忽略不计。（ ）
Instrumental Analytical 仪器分析
第3 章
高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography,HPLC
内容提要
1 高效液相色谱法的特点 2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 4 液相色谱法的固定相 5 液相色谱法流动相 6 高效液相色谱仪 7 高效液相色谱分离类型的选择 8 高效液相色谱法应用实例 9 液相制备色谱 10 毛细管电泳
分数及容量
因子有关。d
固
m
定相的粒度。
D
试
m
样分子在流动相
中的扩散系数。
u流动相线速度.
色谱峰扩展所引起的塔板高度的总变化:
H
2d p
Cd dm u
(
Cm
d
2 p
Dm
Cs
md
2 p
Dm
Csd
2 f
)u
Ds
(3 6)
由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化可归 纳为：
H=A+B/u响柱效的主要因 素是传质阻力项，高效液相色谱的方程可写成：
• 进样方式：将试样注入色谱柱的顶端滤塞上或 注入进样器的液流中。
• 由于进样器的死体积以及进样时的液流扰动引 起色谱峰不对称和展宽。
• 解决：试样注入柱顶端中心点或填料中心 1~2mm处。 b.柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积 所引起.
• 解决：连接管的体积、检测器的死体积应尽可 能小.
Instrumental Analytical 仪器分析
Ds
(3 3)
式中Cs是与k(容量因子）有关的系数。d f固定液的液膜厚度。
Ds试样分子在固定液内的扩散系数。
• 采取措施： • 1）液-液分配色谱：薄的固定相层；吸附、排
阻、离子交换色谱：小的颗粒填料。
• 2）采用扩散系数大的液相固定相。 • 3）减小流动相的流速，改善传质。
（2）流动相传质阻力项(二种形式:在流动的流动相中的传 质和滞留的流动相中的传质)
体表面的流离羟基上形成的固定相称为化学键合固定相 。 • 优点：固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的 多；无固定相流失，增加了色谱柱的稳定性及寿命；可 以键合不同的官能团，能灵活地改变选择性，可应用与 多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提，也有利 于配用灵敏的检测器和馏分的收集。 • 目前反相键合相色谱法，已成为高效液相色谱中应用最 广泛的一个分支，液-液分配色谱极少采用。
3.分离过程：流动相中待分离有机离子与固定相或流动相中带 相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间 进行分配.
X+水相 (被测离子)+ Y－水相(对离子) ↔ X+Y－有机相（疏水）
4.分类
• 正相离子对色谱法：极性固定相-非极性流动相。
• 反相离子对色谱法：非极性的疏水固定相，含有 对离子Y－的甲醇－水（或乙腈－水）溶液作为 极性流动相.
§3.1高效液相色谱的特点
一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。 高效液相色谱是20世纪70年代迅速发展起来的一项 高效、快速的分离技术。（液相色谱+气相色谱理 论+高压泵、高效固定相+高灵敏检测器）。
二、特点 1.高压: 可达150~350×105 Pa
2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20多小 时，用HPLC只需1小时.
3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米）
4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g；荧光检测器10-11g
三、应用范围
气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。 对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型 化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一 定程度的限制，据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱 分析；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它 非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。 。