1953年 Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管
中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液 流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的 流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使 待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过， 外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。 这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
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加入PBS缓冲液（有0.1%的NaN3）1ml洗细胞，1000rpm 离心10min，倾去上清液，加入固定液300ul重悬细胞， BD-FACBCalibur流式细胞仪检测。 细胞的吸入，将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸 管孔处，先预检测样品，然后进行实际检测。课根据细 胞的浓度选择测定的速度（低，中或高）。所有的数据 将自动存入微机。
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6，FCM分析

7，结果判断： + 如上图所示，CD3 T细胞占细胞总数的66.82%，其中 CD4+T细胞占51.59%，CD8+T细胞占14.83% 。
8，注意事项： 确保细胞悬液上机检测前浓度为1×105/ml,细胞浓度过低直 接影响检测结果。 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合实际位点，常用的蛋白 封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的1g对照。
1956年，Coulter 在多年研究的基础上利用 Coulter
效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细 胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存 在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特 性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和 个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年 Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染 色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。 1973年 Steinkamp设计了一种利用激光激发双色 荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行 细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数 技术的主要历程。
3实验材料：
（1）,肝素抗凝人全血 （2）,荧光标记单克隆抗体：抗人CD4-FITC,抗人CD8-PE(美国BD公司产 品） （3）,细胞洗液（含1%FCS的PBS) （4）,红细胞裂解液 （5）,细胞固定液 （25%戊二醛3.2ml， 葡萄糖2.0g加无血清细胞洗液至 100ml）。 . . （6）,FACS缓冲液 1 × PBS 950ML FCS 40ml 10%叠氮钠溶液 10ml . （7）,仪器缓冲液（FACS-flow),FACS清洁液（FACS clean)和FACS洗净液 （FACS rinse)由仪器厂家提供。 （8）,流式细胞仪。 （9）离心机，吸管，试管等。
流式细胞术检测T细胞亚群
组 长： 杜建呈 田 呈（讲解） 小组成员： 李 姚
罗光珍
范成芬 钱洪珍
实 验
一
1 了解流式细胞术的基本发展过程
目
2 掌握流式细胞术的基本原理及应用
的
3 掌握分选T细胞亚群的原理与方法
4 掌握T细胞亚群分选的意义
二，流式细胞术的发展史
Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等 1934年 流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数， 并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们 还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺 次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块 的淤阻。
4，实验步骤
①
混匀抗凝全血，加100ul全血于试管中，分别加入抗人 CD4-FITC,CD8-PE单克隆荧光抗体各10ul，用振荡器混匀， 避光放置15~30min（室温200C~250C) 加入溶血素2ml溶解红细胞，与振荡器上混匀，室温避 光放置10min，1000rpm离心10min，弃上清液。
二）
三）流式细胞仪的工作原理

参数测量原理：流式细胞仪可以同时进行多参数测量， 信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。 样品分选原理：流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器 来完成的。 数据处理原理：FCM的数据显示方式包括单参数直方图 （histogram)，二维点图（dotplot），二维高等图 （contour），假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
3，染色的细胞经照射发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别 被呈900角方向放置的光电倍增管荧光检测器和前向角放置的光电 二极管散射光检测器接收，经过转换器转换为电子信号后，经膜/ 数转换输入计算机。 4，计算机通过相应的软件储存，计算，分析这些数字化信息，就 可以得到细胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性质等物理和 生化指标。


四，T细胞亚群的检测
1，实验内容：流式细胞术检测CD4+，CD8+T细胞。
2，实验原理（1）：T淋巴细胞具有高度的异质性， 根据 其表面的标志和功能特征，可分为若干个亚 群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能。 因此，对淋巴细胞亚群数量的检测能反映机体的免 疫功能状态。本次实验用流式细胞术检测 CD4+,CD8+T细胞。（流式细胞术原理见前面流式细 胞术的基本原理及应用）
注意染色后避光，保障细胞免疫荧光的稳定。样品制备好 后如果不能立即上机检测，须置于40C 冰箱避光保存
9，问题与思考 ① FCM的基本原理是什么？
②
如何使用FCM技术来检测一肿瘤患者的PBMC中 的T细胞组成变化？ 在操作FACS时，有哪些注意事项？ FCM在免疫学中，有哪些具体的运用？请举三 例说明 细胞亚群的检测有何意义？请举例说明
现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发 源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，他在组织 化学的基础上提出了两个新设想 1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的， 即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学 的重要信息。
2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从 而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞 可以同时获得有关不同组分的多方面的信息，用 作鉴别细胞的依据。
三，流式细胞术的基本原理及应用
一） 流式细胞术（FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构
进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
1，其基本原理是将悬浮分散的单细胞悬液，经特 异荧光染料染色后，放入样品管。
2，在气体压力的作用下，悬浮在样品中的单细胞悬液形成 样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向 下流动，流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕 细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆 柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直 相交相交点称为测量区。
③ ④
⑤ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Thank you
实验原理（2）
T淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直接标记的抗人CD 分子McAb结合后，细胞表面形成带有荧光色素的抗原抗体 复合物。经激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长的 荧光，其荧光强度与被测CD分子表达密度成正比例关系， 由此通过流式细胞仪课检测结合含有相应荧光素标记抗体 的阳性细胞百分率。
流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla 和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、 照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基 础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活 性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚 地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这 项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研 究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键 是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并 没有多大差异。 流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计 数技术，以及数据的采集和分析技术等。
④
5使用后的清洗
①
将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1min
②
将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸入 1min
再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔，高速吸 入5min 同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔，高 速吸入5min 最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔，关闭 机器。 将废液槽中的废液倒掉，并清洗干净废液槽。