《分子生物学与基因工程》结课论文Real-Time PCR在分子生物学中的应用姓名：学号：院系：班级：任课教师：二零一二年十二月Real-Time PCR在分子生物学中的应用东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030摘要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。

定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。

该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。

关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。

因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。

1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR ，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。

自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。

但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。

直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。

实时荧光定量PCR（real-timefluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。

1.实时荧光定量PCR技术概述1.1 实时荧光定量PCR原理1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析[3]，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（quencher，Q），两者距离很近时（7-10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨别能力进行定量检测。

荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期[4]。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。

CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1.2 常用实时荧光定量PCR分类1.2.1 实时荧光定量PCR荧光染料法实时荧光定量PCR荧光染料法包括非饱和染料SYBR Green法和饱和染料LC Green法[5]。

非饱和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法简便，不需要设计探针，但是特异性低。

荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。

引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。

饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料SYBR Green相比有如下优点：LC Green染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制PCR反应。

从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。

在进行HRM分析时，由于饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。

除LC Green染料外，常用的染料还有Reso Light、Ever Green等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。

1.2.1 实时荧光定量PCR探针法实时荧光定量PCR寡核苷酸探针法包括TaqMan探针法和TaqMan -MGB探针法。

TaqMan 探针法技术原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。

该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。

探针的5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光淬灭基团。

在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。

在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’—3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。

因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。

荧光信号强度与PCR产物量相对应。

MGB探针与传统的TaqMan探针比较，有很大的优势。

它可以使探针的长度缩短，尤其对AT 含量高的序列的MGB探针的设计有很大的帮助；同时可以提高配对与非配对模板间的Tm值差异；由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可以进行SNP分析。

MGB探针实验步骤简单，使杂交的重复性大大提高。

1.3 实时荧光定量PCR定量方法在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。

绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。

由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。

1.3.1绝对定量法该方法是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量。

绝对定量标准品一般是用质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。

标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。

由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定，所以合适的标准品是定量准确的关键。

一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率，另一方面标准品的定量必须准确。

这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的标准品纯度要高，不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。

该方法的优点就是测定范围很广（10～1010拷贝），结果可直接通过软件得出，不需额外计算。

1.3.2相对定量法相相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA[6]。

使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。

此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。

在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。

由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。

这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致；此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争[7]。

1.3.3相对定量反应循环值（C t）比较法即ΔCT值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。

这两个扩增反应可在2管中分别进行，也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。

该方法不需要标准曲线。

它是根据PCR扩增反应的原理，假设每个循环增加倍的产物数量PCR反应的指数期得到扩增产物的值来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。

比较C t法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到C t值来反应起始模板的量，一个循环（C t=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。

比较不同待测标本DNA的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态进行判断或诊断。