第二章氨基酸类药物第二节氨基酸的生产方法掌握直接发酵生产氨基酸的操作要点；通过赖氨酸发酵生产的工艺过程，熟悉赖氨酸的发酵生产和产品的分离纯化工艺过程教学基本内容：2.2 直接发酵法2.2.1 直接发酵法的原理工业上，发酵实质上是利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。

初生氨基酸：微生物通过固氮作用、硝酸还原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸，或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸也称为初生氨基酸。

次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其它氨基酸。

大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化作用而产生。

有些氨基酸可以以有机化合物和氨盐为前体，在相应酶作用下而产生。

发酵法中氨基酸的碳链主要来自糖代谢中间产物，如草酰乙酸、α-酮戊二酸、赤藓糖-4-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸及分枝酸等。

2.2.2 直接发酵法分类按照生产菌株的特性，直接发酵法可分为5类：1. 使用野生型菌株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸的发酵生产；2. 使用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如赖氨酸（高丝氨酸缺陷）、亮氨酸（苯丙氨酸缺陷）等；3. 由氨基酸结构类似物抗性突变株生产氨基酸，如赖氨酸（S-（2-氨基乙酸）-L-半胱氨酸（AEC）等；4. 使用营养缺陷型兼抗性突变株生产氨基酸，如高丝氨酸（蛋氨酸、赖氨酸缺陷，α-氨基-β-羟基戊酸AHV抗性）等；5. 以氨基酸的中间产物为原料，用微生物将其转化为相应的氨基酸，这一方法主要用于很难避开其反馈调节机制，而难以用直接发酵法生产的氨基酸。

如现已成功地用邻氨基苯甲酸作为前体物生产L-色氨酸，用甘氨酸作为前体工业化生产L-丝氨酸。

发酵法生产氨基酸的基本过程包括培养基配制与灭菌处理，菌种诱变与选育，菌种培养、灭菌及接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤。

(二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺构成动物、植物及微生物体所有蛋白质的氨基酸种类与构型均无任何差异，但植物体内所有氨基酸皆由CO2、氨和水合成，动物体除8种必需氨基酸需从外界摄取外，其余非必需氨基酸均可通过体内氨基酸之间的转化或碳水化合物中间代谢物而合成，而微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成所有氨基酸。

目前绝大部分氨基酸皆可通过发酵法生产，其缺点是产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。

本文仅以L-异亮氨酸及L-赖氨酸直接发酵法为例，说明发酵法的基本过程。

1、L-异亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制备（1）L-异亮氨酸的结构与性质：L-Ile存在子所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一，分子式为C6H13NO2，分子量为131.17，结构式为：（3）工艺过程①菌种培养种子培养基组成（%）为：葡萄糖 2 尿素0.3 玉米浆 2.5豆饼水解液0.1（以干豆饼计）pH6.5。

二级种子培养基另加菜籽油0.4，其余同一级种子培养基。

一级种子培养：1000ml三解瓶中培养基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床30℃培养（冲程7cm，频率105次／min）16h。

二级种子培养：接种量3.5％，培养8h，如此逐级放大培养得足够量菌种。

②灭菌、发酵发酵培养液组成（%）为:硫酸铵 4.5 豆饼水解液0.4，玉米浆 2.0碳酸钙 4.5 pH7.2，淀粉水解还原糖初糖浓度11.5。

在5m3发酵罐中添加3吨发酵培养液，加热至118～120℃，维持在1.1×105Pa压力，灭菌30min，立即通冰盐水冷却至25℃。

接入1％菌种（v／v），维持180转／min的搅拌速度，升温至30～31℃，以0.2L／（min•L）通气量发酵60h，在24～50h之间不断补加尿素至0.6，氨水至0.27。

③除菌体、酸化发酵结束后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。

④离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5％的流速进H十-型732离子交换柱（Φ40×100cm），以100L去离子水洗柱，再以60℃、0.5mol／L氨水按3L/min的流速进行洗脱，分部收集洗脱液。

⑤浓缩赶氨合并pH3～12的洗脱液，70～80℃减压蒸馏、浓缩至粘稠状，加去离子水至原体积的1／4，再浓缩至粘稠状。

如此重复三次。

⑥脱色、浓缩、中和上述浓缩物加去离子水至原体积的1／4，搅拌均匀，加2mol／L盐酸调pH3.5，加上1％（w／v）活性炭，70℃搅拌脱色1h。

滤除活性炭，滤液减压浓缩至适当体积，用2mol／L氨水调pH6.0，5℃沉淀过夜,过滤抽千，105℃烘干得：L-异亮氨酸半成品。

⑦精制、烘干每10kg L-异亮氨酸半成品加8L浓盐酸和20L去离子水，加热至80℃，搅拌溶解，加10kg氯化钠至饱和，加工业液碱调pH10.5，过滤，滤液用碱调pH 1.5，5℃放置过夜。

滤取沉淀，用80L，去离子水加热至80℃搅拌溶解，加适量氯化钠和1%（w／v）活性炭，70℃搅拌脱色lh过滤，滤液减压浓缩至适当浓度，用氨水调pH6.0，5℃放置结晶过夜。

次日过滤收集结晶，抽干，于105℃烘房中烘干得L-异亮氨酸成品。

（4）检验应为菱形叶片状或片状晶体，含量应为98.5％～101.5％，干燥失重不超过0.3％，炽灼残渣不大于含量测定与L-亮氨酸的规定相同。

0.3%，氯化物不超过0.05％，硫酸盐不超过0.03％，铁盐不超过0.003％,重金属不超过0.0015％，砷盐不超过1.5ppm。

（5）作用与用途L-Ile为必需氨基酸，是复方氨基酸输液的重要成份之一。

2、L-赖氨酸（L-Lysine，L-Lys）的制备（1）L-赖氨酸的结构和性质L-赖氨酸存在于所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一。

分子量为146.20，结构为：①菌种培养②灭菌、发酵发酵培养液成分（％）为淀粉水解糖13.5，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸铵1.2，尿素0.4，玉米浆1.0，毛发水解废液1.0，甘蔗糖蜜2.0，pH6.7，灭菌前加甘油聚醚lL（指5m3发酵罐）。

在5m3发酵罐中投入培养液3吨，在1.01×105Pa压力下，加热至118～120℃灭菌30min，立即通入冰盐水冷却至30℃，按10％（v／v）比例接种，以1:0.6（v／v）通气量于30℃发酵42～51h，搅拌速度为180转／min。

③发酵液处理：离心除菌体；80℃加热；④离子交换：铵型732树脂;PH=5.0为饱和(串联)⑤浓缩结晶：收集pH=8.0～14.0洗脱液（氨水洗脱）2.2.3 发酵法的基本过程发酵法生产氨基酸的基本过程包括菌种诱变与选育，培养基配制与灭菌处理，菌种培养、接种发酵，产品提取及分离纯化等步骤。

氨基酸发酵方式主要是液体通风深层培养法，其过程是由菌种试管培养逐级放大直至数吨至数百吨发酵罐。

发酵结束，除去菌体，清液用于提取、分离纯化和精制有关氨基酸，其分离纯化、精制方法及过程与水解法相同。

2.2.4 直接发酵法实例指通过特定微生物在以糖为碳源、以氨或尿素为氮源以及其它成分的培养基中生长，直接产生氨基酸的方法。

L-异亮氨酸的制备工艺流程（1）菌种培养种子培养基组成（％）为：葡萄糖2，尿素0.3，玉米浆2.5，豆饼水解液0.1，pH6.5。

二级种子培养基加菜籽油，其余同一级种子培养基。

一级种子培养：1000ml三角烧瓶中培养基装量为200ml，牛肉膏斜面，接种一环AS1.998菌种，摇床30℃、16h。

二级种子培养：接种量3.5％，培养8h。

逐级放大。

（2）灭菌、发酵发酵培养液组成（％）：硫酸铵4.5，豆饼水解液0.4，玉米浆2.0，碳酸钙4.5，pH7.2，淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。

灭菌，接种1％菌种（v/v），搅拌，发酵。

（3）除菌体，酸化发酵结束后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。

（4）离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5％的流速进H＋型732离子交换柱（φ40 ×100cm), 以100L去离子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速进行洗脱。

分部收集洗脱液。

（5）浓缩赶氨（6）脱色、浓缩、中和（7）精制，烘干2.2.5 工艺过程评价微生物利用碳源、氮源及盐类通过发酵法几乎可合成所有氨基酸。

该法的缺点是产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。

2.3 酶法转化2.3.1 概述酶法是应用完整的菌体或自微生物细胞提取的酶类制备氨基酸的方法。

赖氨酸、色氨酸等均可用酶法进行制备。

在发酵工业中早在1973年就用固定化菌体的方法生产天冬氨酸。

将酶或细胞进行固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反应器中制成所谓“生物反应堆”，加入相应底物合成特定氨基酸，反应液经分离纯化即得相应氨基酸成品。

其分离纯化和精制的原则及方法与水解法相同。

酶工程法与直接发酵法生产氨基酸之反应本质相同，都属酶转化反应，但前者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化。

两者相比，酶工程技术工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。

如聚丙烯酰胺凝胶包埋的精氨酸脱亚胺酶用于生产L-瓜氨酸，37℃反应半衰期为140天，可连续使用300天。

固定化酶凡限制在一定的空间范围内并能连续反复的使用的酶都称为固定化酶。

通常采用的固定化方法可大体概括为四种类型：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法。

吸附法这是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，又可分：物理吸附和离子交换吸附。

物理吸附是通过氢键、疏水键和π－电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。

常用的载体有：皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶和微孔玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原、赛珞玢以及火棉胶等有机吸附剂。

最常用的交换剂有CM（羧甲基）－纤维素、DEAE（二乙基氨基乙基）－纤维素、DEAE－葡聚糖凝胶等。

离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，约50～150mg蛋白／g载体。

共价偶联法这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。

常用的载体有：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、乙烯与顺丁烯二酸酐共聚物、聚苯乙烯、尼龙等；还有无机载体如多孔玻璃等。

交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与惰性蛋白间、或酶分子与载体间进行交联反应以共价键制备固定化酶。

包埋法将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。