450-500 P.E.
# range. ——p70,oligo7 manual
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
与primer premier6界面类似，增加了设计引物的种类，可用于设
计各种实时定量的引物和探针，分子信标等。
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
一 前言
如何设ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ引物？
遵循引物设计的原则 设定引物的一些参数 利用引物设计软件搜索，评价引物
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二 引物设计原则
1.引物的长度
引物的长度一般选择在18-27个碱基之间，过长和过短都会降 低引物结合效率。
2.引物的Tm值
引物的Tm值一般选择在55-65℃之间，上下游引物之间Tm相差 不宜超过4℃。 Tm值：两段互补的碱基序列解链50%时的温度 估算Tm=4*(G+C)num+2*(A+T)num
此外，Beacon Designer增加了标记外显子的选项，使得方便设计跨外 显子的引物，提高实时定量引物的特异性。 Locate exon + Junction Primer serach
三 常用软件使用方法
4.Beacon Designer8
导出引物信息为表格文件-Export Results
引物设计的原则以及
常见引物设计软件的使用
伏东科 20150618
目录
一 前言 二 引物设计原则 三 常用软件使用方法
四 常见问题
一 前言
什么是引物？
引物（primer），又称引子，是一小段单链DNA或RNA，用来作 为DNA复制的起始点（终点）。
生物的DNA复制
RNA引物
聚合酶链式反应（PCR）
Any Question You Have？
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
序列编辑-edit
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
引物二级结构分析——Analyze
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
保存结果——File—>save
三 常用软件使用方法
3 Oligo7——核心参数（PE，引发效率）
PCR primers may be balanced by using their P.E. # or by their Tms. Excellent results have been obtained for multiplex PCR (10 pairs) when all the primers were within a
反应体系中引物的？
……
2.文献中的引物直接用于PCR，未扩增出条带或杂带很多 文献来源杂志的影响力和可信度？ 是否在合成引物之前用软件进行评价？
反应条件，使用仪器不同的影响？
四 常见问题
3.扩增片段大小与预期不一致 模板序列是否正确？ 模板发生突变？ 引物错配？ PCR产物测序验证
… …
Thank you！
人工合成的引物（通常为DNA引物）。
一 前言
为什么要设计引物？
1. DNA聚合酶不能从头合成DNA，在
5’
DNA复制过程中，DNA聚合酶仅仅可以
把新的核苷酸加到已有的DNA链上，在 整个过程中引物起到了提供3’OH的作
用。
2. 引物与模板DNA上某一特定位点互 补配对，决定要扩增的DNA的位置。
3’
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
选中当前引物窗口，点击菜单栏中的edit->copy可以复制当前引物， Fuction选项中的edit可以编辑当前引物，Report选项可以查看引物的 二级结构，Graph可以查看Tm，GC含量的曲线。
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
Open一个已有序列文件，或new一个序列，可以用ctrl+V快捷键
我怕中文输入法
三 常用软件使用方法
1.Primer premier5
点击primer进入引物设计界面，点击search设置搜索参数，OK开始 查找引物,Ok会显示查找成功的引物列表,点击选中某一对引物会出 现引物和PCR产物的详细信息
二 引物设计原则
3.引物的GC含量
引物的GC含量一般应为40%~60%，引物的GC含量影响引物的Tm值。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、 T或G、C尾巴。
3.引物的碱基随机分布
引物序列的碱基应该随机分布，避免局部GC或AT富集，避免引物内 部出现重复序列
二 引物设计原则
5.避免模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。各种引物设计软 件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。
6.引物的特异性
引物应当与模板特异性结合，避免与模板其他位置错配（false priming），尤其是引物的3’端。3’端不应超过3个连续的G或C， 因为这样会提高引物在G+C富集序列区错误引发率。
Tips：引物与模板DNA基因组BLAST
false priming
二 引物设计原则
7.避免引物间二级结构
避免引物形成发夹（Hairpin），自身二聚体（self-dimer），异
二聚体（cross-dimer）等二级结构，影响引物与模板的结合效率。
self-dimer
Hairpin cross-dimer
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6也增加了在线BLAST的功能和模板二级结构的分析
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 Oligo7是java语言编写的软件，需要正确安装java运行时环 境（JRE）
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
打开一段序列（核酸或者蛋白）
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三 常用软件使用方法
引物设计常用软件
pp5
pp6
Primer premier 系列
操作简单，容易上手
Oligo系列 oligo7
非常专业，参数更加详尽， 打分更加复杂，可以设计 多种引物
Beacon Designer 系列
BD8
实时定量引物和分子信标 设计的最佳软件
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-信息窗 显示当前的引物和选中的寡核苷酸的基本信息，以及标注的序列的特征
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-全局窗口
三 常用软件使用方法
3 Oligo7 默认窗口组成-局部窗口
三 常用软件使用方法
3 Oligo7
引物查找-search
三 常用软件使用方法
软件的获取
如果你热衷于Macintosh OSX
以上软件均有Macintosh版本
或者你是Linux控
你可以选择命令行下的primer3
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四 常见问题
1.软件分析无误，PCR实验出现杂带
是否与对应物种基因组进行BLAST？ 退火温度设置是否合理？ 引物长度是否过长或过短？
Primer premier6在界面上迎来了较大的改变，可以同时对多对序列设计 引物，
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6增加了引物评价的功能
三 常用软件使用方法
2.Primer premier6
Primer premier6也增加了标记SNP的功能