图8-3 NASBA原理示意图
感染性疾病的分子诊断
nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
感染性疾病的分子诊断
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评 价
• 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价 及疾病预后等。
• 耐药性的检测 • 细菌的分型 • 流行病调查
感染性疾病的分子诊断
第一节 病毒的基因检测
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝 炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
感染性疾病的分子诊断
3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关 信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样 本中仍可以检测出相应的病原体。 有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。
4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能 说此病原体就是引起疾病的直接原因。 该病原体可能是一种正常菌群
感染性疾病的分子诊断
IgG 临近恢复期出现 IgA
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
感染性疾病的分子诊断
二、感染性疾病分子诊断的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 • 信号放大技术检测方法
靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得 到放大。 • 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增 • PCR、替代扩增、LCR等
第八、九章 感染性疾病的分子诊断
感染性疾病的分子诊断
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
感染性疾病的分子诊断
感染性疾病：由某种病原体所致， 通过不同方式引起人体发生感染并 出现临床症状的疾病。
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
5' cDNA RNAseH
3' RNA 5' cDNA
图8-3 NASBA原理示意图
感染性疾病的分子诊断
nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
感染性疾病的分子诊断
病毒结构：大 小：20-300nm 核心区：核酸（DNA或RNA） 外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
感染性疾病的分子诊断
一、 乙型肝炎病毒
我国是HBV高流行区，50%－70%的人 受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝 炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬 变，HBV又与原发性肝癌密切相关。 外壳（HBsAg): 外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)： DNA
• NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器， 不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制， 循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR， 特异性好。
感染性疾病的分子诊断
引物A 5’端带
5' 引物A
有T7RNA聚
3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
感染性疾病的分子诊断
引物A 5’端带
5' 引物A
有T7RNA聚
3'
合酶结合位点， 5'
3’端碱基与靶 3'
RNA 3’端序
5'
列互补;引物B
的碱基序列与
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
• 3.2kb双链DNA病毒 • 不完全双连环状DNA
长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg） C区编码HBeAg 、HBcAg p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。
短链S为正链：长短不一 感染性疾病的分子诊断
pre-s1
pre-s2
• 完整性策略：
• 检出病原体 • 分型（分类）－亚型－耐药性 • 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
感染性疾病的分子诊断
感染性疾病分子诊断标志物
• 病原体核酸分子（DNA/RNA）
• 基因表达产物
• 代谢物
• 免疫应答分子
细
胞
T
免
疫
致敏T细胞
T
淋巴因子
体
ห้องสมุดไป่ตู้
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
DNA 聚合酶 HBcAg
感染性疾病的分子诊断
Dane颗粒（完整的病毒）形态
HBsAg
（外膜蛋白）
HBcAg
（核衣壳蛋白）
HBV DNA
DNAPol
完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心感染直性径疾病为的2分7子纳诊米断 ， 内含DNA双链和DNA多聚酶
（一）病毒基因组结构
病原体：病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、
寄生虫
。
感染性疾病的分子诊断
常规检测方法：
•
免疫学方法
•
微生物学方法
受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，
并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
感染性疾病的分子诊断
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体）：
• 判断有无感染 • 是何种病原体感染 • 常用方法：PCR ＋ 杂交
5'
cDNA 3’端序
3'
列互补
T7RNA聚合酶
5'
3'
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
5'
引物A 5'
3'
5'
100-1000 RNA扩增子
3'
5'
3'RNA
5' 3'
引物B
5' cDNA RNAseH
3' RNA 5' cDNA
HBV基因组结 构
S
P
HBV DNA 3.2 kb C
pre-c X
pre-S1 pre-S2 S pre-C C P X
感染性疾病的分子诊断
三、感染性疾病分子诊断的标本处理
• 标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等 及对标本进行合适的传送、保存和预处理。
感染性疾病的分子诊断
四、感染性疾病分子诊断的结果解释
1. 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子
2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染