2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去 75％的杂蛋 白，纯
度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用 2～3mol/L 浓度的（NH4）2SO4 保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。
2、影响盐析的因素有那些
~
答：盐析的影响因素①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实 际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度 即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用， 除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更
{
华南师范大学实验报告
学生姓名： 黎嘉俊
学
号：008
专业：
生物工程
年级、班级：10 工程一班 课
程名称：生物工程下游技术实验 实验项目：盐析β-D 甘露聚糖
酶
>
活力测定
实验类型：□验证□设计□综合 实验时间：2013 年 9 月 24 日
实验指导老师：江学文
实验评分：
一．实验目的
1、掌握β-D 甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。 2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D 甘露聚糖活力的操作方法。
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突 出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～ 4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在 0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。
721 型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。的醋酸缓冲液
四、实验步骤
1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在 4000rpm，离心 10min。收集沉淀，加 约 20 毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。 （透析袋处理：剪成 15 ㎝长度，沸水浴中煮 10min，捞起、扯开，在一端 1 ㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏 为止。处理过程中需戴手套！） 2、酶液倒入透析袋后，另一端 1 ㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口， 浸于 4～5℃的蒸馏水中（250ml 烧杯），持续时间，并不时搅拌，期间每隔 20min 更换 1 次 4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约 150 毫升。 注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！ 2、透析同时可准备 2 支 50ml 的比色管，各加魔芋精粉，加的醋酸缓冲液溶解。
五．实验结果
（
0.1%标准甘露糖溶液体积/ml OD1 OD2 OD3 OD平均值 OD标准差
0
2
4
6
8
1
0
0.097 0.416 0.873 1.256 1.674
0
0.097 0.415 0.874 1.256 1.674
0
0.097 0.415333 0.873333 1.255333 1.674
0
0 0.000577 0.000577 0.001155
0
六．分析与讨论
（1）本次实验的第一步是标准曲线的制作，在使用分光光度计测定OD值时发现， 加入的%标准甘露糖溶液体积为10ml的比色管的试样测出的OD值略大，正常来 说OD值若大于时虽进行稀释否则误差较大。据分析多组的数据显示装有10ml的 试样测出的OD值多数超过，可能是试样浓度太大引起，但超出范围较小，在可 以接受的范围内，而且曲线的上升趋势仍然正常，没有出现较大程度的偏离，相
华南师范大学实验报告
学生姓名： 黎嘉俊
学
号：008
专业：
生物工程
年级、班级：10 工程一班 课
程名称：生物工程下游技术实验 糖
实验项目：黑曲霉β-D 甘露聚
酶的纯化
实验类型：□验证□设计□综合 实验时间：2013 年 9 月 17 日
实验指导老师：江学文
实验评分：
一．实验目的
<
1、粗酶的制备 2、硫酸铵分级沉淀 3、透析袋的处理方法和使用
∴酶活力（u/g 湿基）=
×
，
=16330×10×20×40/（2×27）×1/4
≈×108u/g
六、分析与讨论
(1)本次实验是基于第一次实验的标准曲线的基础上进行的，在测量 OD 值的时候 不需要用第一次实验的空白对照，因为测量出来的样本 OD 和样本空白 OD 相减 能消去空白 OD 的值，因而可以把样本空白 OD 作为对照，调零操作，直接能显 示样本 OD 减去样本空白 OD 的结果作为实验的结果。本次实验测量的结果偏大， 有第一台仪器测量能达到，另一台仪器的结果比较合适，为左右，但仍比正常的 数值偏大很多，数值不在实验第一步得出的标准曲线上，不在标准曲线的适用范 围内的数值的话，带入得出的公式误差会很大。通常测量的 OD 值取用范围在以 内，超过该数值误差比较大，若要再进行实验最好进行稀释，测量得出的 OD 值 再乘以稀释倍数。若直接取用本次的较大的测量数据也能带进公式求出，不过误 差较大。 (2)本次实验测量的 OD 值偏大，经过观察发现比色杯里面有絮状悬浮杂质，而且 液体的颜色明显偏深，进行实验之前其实最好进行过滤再进行 OD 值的测量。而 且实验的各组出现的情况也相同，都是 OD 值偏大，都能上到，可能实验用的酶 液的原料也不纯，有杂质等原因。 (3)实验的第二步，酶液倒入透析袋后，浸于 4～5℃的蒸馏水中（250ml 烧杯）， 持续时间，并不时搅拌，期间每隔 20min 更换 1 次 4～5℃的新鲜蒸馏水，以利
二．原理
1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质 分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集 并从溶液中析出。 2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为 39000 和 40000，选择 MWCO（切割分子量或截留分子量）14000 的透析袋，透过掉分子量小于 1000 的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
关系数为，而且图中个点的位置都在标准曲线的附近并没有偏离太多，均匀分布
在曲线的两端，结果比较理想，因而该曲线符合实验的要求。
（2）本实验的第二步为转速 135rpm，摇床摇 60 min 后，用￠15 ㎝滤纸过滤， 耗时较长而且效果不太好，可以采用高速离心，转速 8000rpm，10min，溶液分 层明显，然后直接用滤纸过滤仍然有较好效果，且耗时短，过滤时如遇到过滤较
③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物， 温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶 液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的 溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要 求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在 0℃～4℃下 操作，以避免活力丧失。
B
25 20 2 1.5
n
1 4
27
B 所测吸光度值在标准曲线上的葡萄糖 g / ml； 25 测吸光度时比色管定容体积，ml； 20 溶解沉淀的体积,ml； 2-水解消耗的酶液体积； n 反应液稀释倍数； 4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g（湿基）
…
OD1 OD2 OD3 OD平均值 OD标准差
样本OD值-样本空白OD值 2.523 2.519 2.524 2.522
0.002645751
∵Y=（样本 OD 值-样本空白 OD 值）=
∴Y=→x=Y/=≈
又∵%标准甘露糖溶液浓度为 1mg/ml
∴酶活力（u/g 湿基）=
×
又∵反应液的稀释倍数 n=20/(2/6×=40
B=×1mg/ml×103=16330
4、2 支溶有魔芋精粉的 50ml 比色管，1 支加透析好的酶液 2ml；另 1 支加 灭活的透析酶液 2ml（用做对照），55℃水浴下反应 10 min，取出，立 即进行下面操作：事先准备 2 支 50 ml 的比色管，1 支加 DNS 试剂，立即加
酶解反应液；另 1 支加 DNS 试剂，立即加对照管的酶解反应液，2 管同时沸水
难的情况，可以更换滤纸继续操作。
（3）实验的第三步是取滤液 40 毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克， 待加入部分溶解后再加入剩余部分，否则不能沉淀出绝大多数的蛋白质，影响实
验的结果，造成误差。
七．思考题
1、（NH4）2SO4 沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些 答 ：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白 质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最 广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不 需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。
迅速达到平衡，因为酶液的处理条件比较温和，尽量在低温条件下处理，以免酶 失活。而且透析的过程中要不断搅拌，这样可以加快铵根离子的排除，减少后面 实验结果的误差，也能缩短实验时间。但是操作的时候要注意，要封好透析袋的 两个口，不能让外面的水进去，否则会引起较大的误差。
`
中性盐沉淀蛋白质的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH 都是亲水基团， 这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm～ 100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性 基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度 也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水 性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏 了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。
大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通 常认为比较适中的蛋白质浓度是％～％，相当 25mg/mL～30mg/mL。