生物工程与下游技术知识点整理第十三章β内酰胺类抗生素1、（掌握青霉素的性质并分析流程，会设计提取分离纯化的流程）青霉素的理化性质（1）酸碱性：有一个酸性基团；解离常数pK值为 2.7；（2）溶解度：青霉素是有机酸，易溶于醇，酸，醚，酯；氯仿是多种青霉素游离酸的很好溶剂；在水中溶解度很小，迅速丧失抗菌能力；青霉素的金属盐易溶于水；易溶于低级醇；略溶于乙醇，丁醇，酮类，醋酸乙酯；含有少量水分时，溶解度大大增加；不溶于乙醚，氯仿，醋酸戊酯；青霉素的分离纯化工艺（工业钾盐生产工艺流程）课本277页发酵液，冷到10℃下，1/3体积中性过滤，板框压滤或鼓式过滤，10％硫酸调pH5，加PPB溶液（十五烷基溴化吡啶，絮凝剂），板框过滤或鼓式过滤，冲水量20－30％；滤洗液；加1/3BA（醋酸丁酯），加PPB，10％硫酸调pH2－2.5，逆流萃取；得一次丁酯萃取液；加0.3％活性炭搅拌10min，压滤，－10℃冷冻脱水，水分在0.9%以下，过滤得BA清液；加温到15℃，加醋酸钾－乙醇溶液适当搅拌，结晶后静置1h以下，甩滤，得湿晶体；湿晶体放洗涤罐，丁醇（4－6L/10亿）洗涤，乙酸乙酯（2L/10亿）顶洗，挖出粉子真空干燥；得青霉素G钾盐成品；2、头孢菌素C（1）头孢菌素C性质：为两性化合物，C为氨基酸，水溶性很大，稳定性差；大孔网状吸附剂从发酵液中初步分离头C，离子交换法纯化，络盐沉淀法结晶；（2）分离纯化工艺流程头C发酵液，硫酸酸化，板框过滤，得头C滤液；大孔网状吸附剂吸附，得饱和树脂；丙酮水溶液解吸，得一次头C解吸液；阴离子树脂吸附，醋酸钠解吸；加醋酸锌，得头C锌络盐结晶；板框过滤，得头C锌盐湿品；气流干燥，得头C锌盐成品；（3）头C分离纯化工艺要点A、发酵液预处理发酵液冷到15℃以下，硫酸酸化到pH2.5－3，放置一段时间；板框或真空鼓式过滤机过滤，并用水顶洗滤渣；收集，合并滤液，洗液，低温10℃保存；B、大孔网状吸附剂的吸附和解吸头C最适吸附pH2.5－3，XAD4的吸附容量为15－20g/L；2－4倍体积去离子水洗涤，除去硫酸根等阴离子，以免干扰离子交换树脂的纯化；15－25％乙醇，丙酮，或异丙醇水溶液来解吸。

C、离子交换树脂的纯化采用弱碱性阴离子交换树脂，树脂用醋酸溶液处理成醋酸型，开始吸附；去离子水洗涤树脂，1.5－2.5％醋酸钠（钾）水溶液解吸；D、沉淀结晶头C可与二价重金属离子铜锌钴铁铅Ni形成难溶性络盐微晶沉淀；锌盐最普遍；头C锌盐，淡黄色微晶粉末，不溶于水及氯仿，甲醇，乙醇；离子交换解吸液，放结晶罐中，5℃，加醋酸锌，搅拌溶解，加结晶液体积30％的乙醇或丙酮，析出头C锌盐微晶沉淀；选择性较差，需在一定浓度下才能析出络盐结晶；只适用于纯化后的头C溶液；E、膜分离发酵液通过微孔滤膜MF，除去菌丝，固形物；超滤UF（除大分子物质），除去分子量10000以上的蛋白质，多糖，深棕色色素，获得色浅的头C滤液；反渗透膜RO浓缩（除水）3、克拉维酸的分离纯化（1）萃取：溶剂萃取法发酵滤液，盐酸调pH2，3/4体积正丁醇，多级逆流萃取，5℃萃取；1/20体积水，用20％氢氧化钠水溶液调pH7；液液离心机，水相反抽提液；浓缩洗脱液，5℃Zerolit FFIP氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度吸脱，合并活性部分，减压浓缩；Amberlite XAD4树脂脱盐，能吸附克拉维酸，不吸附无机盐；1％正丁醇或无盐水洗脱，混合活性部分，真空浓缩和冷冻干燥；（2）离子交换：吸附于强碱性阴离子交换树脂上，用含盐水溶液洗脱；发酵滤液，pH6.2，通过Zerolit FFIP氯型强碱性阴离子交换树脂，冷的1mol/L氯化钠洗脱；浓缩液，pH6，25℃的滤液，通过Amberlite XAD4树脂，用0.1mol/L氯化钠洗涤，5℃无盐水洗脱；脱盐浓缩液，离子交换色层分离；Zerolit FFIP树脂氯型阴离子交换树脂，0－0.35M氯化钠梯度洗脱，5℃；浓缩洗脱液，5℃Amberlite XAD4树脂脱盐，混合活性部分，浓缩和冷冻干燥。

第十四章氨基糖苷类抗生素1、离子交换法分离纯化链霉素（强碱）的工艺发酵液，1－2倍量水稀释，（高价离子在稀溶液中优先吸附）草酸酸化，pH2.8-3.2，加热70－75℃，板框过滤或固体排出式离心分离，冷到15℃以下；10%氢氧化钠中和pH6.7－7.2，110－Na型树脂吸附，得饱和树脂，水洗到澄清，5－6％硫酸洗脱；洗脱液；401树脂吸附，得饱和树脂，先用无盐水挤压，再以8％硫酸单罐循环洗脱3－4次；得二次洗脱液，1X14H型精制，330－OH型中和；调pH4.3－5，0.2-3％炭，透光度90％以上；小于35℃薄膜浓缩，硫酸调pH4.5，加2－3％活性炭，得酸性脱色液；氢氧化钙调pH5.5-6，加1.5％－2％活性炭到透光度90％以上；无菌过滤，喷雾干燥进风120－135℃，出风84－85℃；2、卡那霉素的分离纯化工艺（1）硫酸卡那霉素：易溶于水，不溶于乙醇(水中加乙醇沉淀)，丙酮，苯，醋酸乙酯；（2）分离纯化工艺流程发酵液，盐酸调pH5－5.5，加水稀释，1X12H型强酸阳离子树脂吸附，搅拌4h，用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子；强碱型树脂201X4脱色，2－2.8％氨水洗脱，硫酸调pH3.2－3.4，乙醇中结晶2h，离心得粗晶；95％及50％乙醇分次洗涤，无盐水溶解到20万u/ml，调pH7，加1－5％活性炭脱色达滤；精制液，无菌过滤，喷雾干燥，进风116℃出风88℃，得粉针剂原药；精制液，制成水针剂；3、庆大霉素的分离纯化工艺（1）庆大霉素：易溶于水，不溶于乙醇，丙酮，氯仿，乙醚，苯；（2）分离纯化工艺流程发酵液，盐酸调pH1.5－2.5，氢氧化钠中和到pH6.8－7.2；加水稀释；1x2H型吸附6h；得饱和树脂；用稀盐酸，氯化铵洗涤，无盐水洗到无氯离子，4－5％氨水洗脱；强碱性201x4脱色；浓缩去氨，10％硫酸调pH5，加4％活性炭，40℃脱色；成品浓缩液；无菌过滤进风115℃，出风85℃，得硫酸庆大霉素成品；第十五章四环类抗生素（两性物质，沉淀法）四环类抗生素的分离纯化沉淀法：四环类抗生素在碱性下能和钙，镁，钡，某些季铵碱形成复合物而沉淀；一）钙镁1 四环素：发酵液调pH9，加氯化钙形成钙盐沉淀；将沉淀以草酸溶解，析出草酸钙；过滤，滤液调pH4.6－4.8；析出四环素粗碱；粗碱溶于草酸水，活性炭脱色；调pH4，得四环素碱成品；2金霉素：发酵液加碳酸钙，氯化镁，调pH7.8形成沉淀；沉淀用草酸－盐酸调pH1.6－1.7溶解；加黄血盐（除铁离子），硫酸锌去蛋白；过滤，加4－6％盐酸，升温40℃，金霉素盐酸盐析出；3土霉素加0.5-1％溴代十六烷吡啶（季铵碱），调pH9.6-10；沉淀析出；沉淀用水洗涤，溶于4份体积5％草酸和1份体积浓盐酸；得到的溶液pH1－1.2；活性炭脱色；调pH4－4.5；析出土霉素碱粗品；第十六章大环内酯类抗生素（弱碱，萃取）1、性质：无色碱性化合物，微溶于水，在水中溶解度随温度升高降低；易溶于醇酮酯（醋酸乙酯，醋酸丁酯），氯仿；易溶于酸性水溶液且成盐，盐易溶于水2、红霉素分离纯化工艺（溶剂萃取法）（1）单纯溶剂萃取法提取红霉素发酵液预处理：加甲醛，硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤，滤洗液；萃取：BA（醋酸丁酯）二级逆流萃取，一级pH10－10.2，二级pH10.4-10.6；一次BA萃取液；反萃取：醋酸缓冲液作二级逆流萃取，一级pH5，二级pH4.6；醋酸缓冲液；萃取：BA作二级萃取；二次BA萃取液；结晶：加10％丙酮，－5℃静置24－36h；离心，蒸馏水洗涤，得湿晶体；干燥：制颗粒干燥20h，70－80℃真空干燥；得红霉素碱成品；（2）溶剂萃取法结合中间盐沉淀的工艺流程发酵液预处理：提取：BA二次逆流萃取，BA萃取液；中间盐沉淀：缓缓加入计量的乳酸，加完后继续搅拌30min；得红霉素乳酸盐湿晶体；BA洗涤，55℃干燥；干晶体；搅拌下加入计量的水－丙酮液溶解，pH6左右；氨水或碳酸氢钠调pH10，搅拌30min，55℃，得红霉素湿晶体；甩滤，水洗到pH7－8，55℃烘干，得红霉素碱成品；（3）大孔树脂吸附法的工艺流程发酵液，0.1%甲醛，3％硫酸锌，氢氧化钠调pH7.8－8.2；过滤；树脂吸附：CAD40树脂吸附，流速1/25v/v.min；树脂洗涤：饱和树脂，40℃水洗涤；树脂解吸：氨水pH10，丁酯用2％氨水混合，流速1/130v/v.min；丁酯萃取液；反萃取：pH4.7－5.2，醋酸缓冲液；BA萃取：碱化pH9.8－10，38－40℃；结晶：加10％丙醇，－5℃静置24h离心过滤洗涤；干燥：湿晶体，制颗粒，70－80℃干燥；得红霉素碱成品；3、麦迪霉素分离纯化工艺发酵液，草酸酸化pH2.5-3；滤洗液；氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取二次；得一次BA萃取液；盐酸调pH2-2.5，一次酸水提取液；氢氧化钠调pH8.5-9，BA提取2次；盐酸调pH2-3.5，蒸馏水提取；去残溶剂：减压空气搅拌；结晶：5%氢氧化钠调pH8.5-9，40℃搅拌20min；洗涤，干燥：热pH8.5无盐水洗涤，60-70℃真空干燥，得成品；4、螺旋霉素分离纯化工艺发酵液，加硫酸铝，搅拌20min，过滤，得滤液；加15-20％BA，氢氧化钠调pH9，得BA萃取液；洗涤：无盐水洗涤BA；5-10％磷酸缓冲液，补加6M盐酸调pH2-2.5；得磷酸缓冲液；除残余BA后过滤；结晶：10M氢氧化钠调pH9，升温到60℃，保温20min；得湿晶体；分离去母液；干燥：70-80℃真空干燥；得螺旋霉素成品；第十七章氨基酸类药物的分离纯化1、氨基酸的理化性质（1）物理性质无色晶体，具特殊晶型；易溶于酸碱溶液；在水中溶解度差异大，精氨酸，组氨酸，赖氨酸（都是碱性氨基酸）溶解度最大；胱氨酸，酪氨酸溶解度最小；不溶于有机溶剂，但脯氨酸溶于乙醇；（2）两性解离及等电点PI（可用等电点沉淀法）带电情况取决于溶液的pH；pH＞PI时，氨基酸带负电；pH＜PI时，氨基酸带正电；pH＝PI时，溶解度最低，易于沉淀；不同氨基酸PI各异；同一pH下各种氨基酸所带电荷的质和量不一致，可应用离子交换法或电泳法分离；2、氨基酸分离纯化实例（给出条件会设计）胱氨酸（1）特性：六角形片状白色结晶，或结品性粉末，无味，pI4.6；难溶于水，不溶于乙醇，乙醚，及其他有机溶剂；易溶于酸碱溶液中，热碱液中易分解；（2）提取和纯化：毛发酸水解，等电点沉淀，盐酸溶解，活性炭脱色，除酪氨酸，结晶；水解：人发或猪毛，洗净，2倍量10M盐酸，预热70－80℃，间歇搅拌，1－1.5h内升温到110℃，6.5－7h；过滤，得滤液；中和：用30－40％的氢氧化钠中和到pH4.8，继续搅拌15min，复测pH，放置36h，过滤得胱氨酸粗品；滤液可分离精氨酸，亮氨酸，谷氨酸初步纯化：取胱氨酸粗品，加10M盐酸，加热到65－70℃，搅拌溶解30min，加2％活性炭，升温到85－90℃，保温30min，过滤，滤液加热到80－85℃，搅拌，用30－40％氢氧化钠中和到pH4.8，静置，结晶析出，趁热过滤得沉淀，离心甩干；滤液回收酪氨酸；纯化：取胱氨酸沉淀，加1M盐酸，加热到70℃溶解，加活性炭，升温到85℃，搅拌30min脱色，过滤，得无色透明澄清滤液；加15倍蒸馏水，加热到75－80℃，搅拌下用12％氨水中和到pH3.5－4；胱氨酸结晶析出；过滤得胱氨酸结晶；蒸馏水洗到无氯离子，真空干燥；异亮氨酸（1）特性：无臭，味微苦；pI6.02；几乎不溶于乙醇或乙醚；乙醇中形成菱形叶片状或片状结晶；溶于热乙醇，25℃在水中溶解度4.17，7.5℃为6.08；（2）制备，分离，纯化菌种培养与发酵：菌种AS1.998；种子培养基：葡萄糖，尿素，玉米浆，豆饼水解液，pH6.5；1000ml三角瓶装200ml；30℃摇床培养16h；二级种子：另加菜籽油；接种量3.5％，培养8h；发酵培养基：硫酸铵，豆饼水解液，玉米浆，淀粉水解糖，碳酸钙，pH7.2；30－32℃，通气发酵60h，25－50h间不断补加尿素，氨水；预处理：发酵液100℃10min，冷却过滤，滤液加硫酸和草酸调pH3.5，过滤除沉淀；离子交换分离：滤液以 1.5％树脂量的流速经007X1（732）阳离子交换树脂H型（40X100cm），100L去离子水洗涤，氨水（60℃，0.5M氨水）以3L/min流速洗脱，分步收集；合并pH3－12的洗脱液，70－80℃减压蒸馏浓缩到黏稠状，加去离子水，浓缩，重复三次，以除去氨；脱色，浓缩，结晶：浓缩液加去离子水到原体积的1/4，搅拌均匀，2M盐酸调pH3.5，加1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；2M氨水调pH6，5℃过夜，滤取沉淀，105℃烘干得异亮氨酸粗品；精制：取异亮氨酸粗品，加浓盐酸，去离子水，加热到80℃，搅拌溶解，加氯化钠到饱和，用氢氧化钠调pH10.5，过滤，滤液用盐酸调pH6，5℃过夜，滤取沉淀；沉淀用去离子水加热80℃溶解，加氯化钠和1％活性炭，70℃搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩；氨水调pH6，5℃结晶过夜；滤取结晶，105℃烘干得异亮氨酸粗品；天冬氨酸（酸性氨基酸）（1）特性：白色菱形叶片状结晶，pI2.97；溶于水及盐酸，25℃水中溶解度0.8，75℃水中为2.88；不溶于乙醇，乙醚；（2）制备，分离，纯化天冬氨酸酶的制备：大肠杆菌AS1.881，斜面：肉汁培养基；摇瓶：玉米浆，延胡索酸，硫酸镁，氨水调pH6；37℃振荡培养24h；逐级扩大培养；发酵液用1M盐酸调pH5，45℃1h，冷却到室温，离心收集菌体（含天冬氨酸酶）；细胞固定：湿菌体，悬浮于生理盐水，40℃保温，加明胶溶液（40℃，12％），戊二醛溶液，充分搅拌均匀，5℃过夜，切成3－5mm的立方小块，浸于戊二醛溶液中过夜；蒸馏水充分洗涤，滤干得含天冬氨酸酶的固定化细胞；装于填充床式反应器，制成生物反应堆，备用；转化反应：延胡索酸铵底物液37℃，按一定流速流过生物反应堆，收集转化液；分离，纯化：过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜；滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，105℃干燥得天冬氨酸粗品；粗品用稀氨水溶解成15％溶液，加1％活性炭，70℃搅拌脱色1h，过滤，滤液用1M盐酸调pH2.8，5℃结晶过夜，滤取结晶，少量冷水洗涤，抽干，85℃真空干燥得天冬氨酸精品；谷氨酸分离纯化利用谷氨酸与锌作用,在pH6.3条件下生成难溶于水的谷氨酸锌盐沉淀,达到从谷氨酸发酵液中分离谷氨酸的目的。