Westen blot一、配胶（一）安装胶架（二）配胶1、分离胶：10%（10ML）O 4 mlDdH230%Acr 3.3mlTris-Hcl(8.8) 2.5ml10%SDS 0.1ml10%过硫酸铵AP 0.1mlTEMED O.OO4ML2、积层胶: 4mlO 2.7 mlDdH230%Acr 0.67mlTris-Hcl(6.8) 0.5ml10%SDS 0.04ml10%过硫酸铵AP 0.04mlTEMED O.OO4ML注意事项：1、TEMED催化AP产生自由基，加速Acr凝胶聚合，一般于4度存放。

不宜多加，否则胶易变硬脆裂。

2、TEMED易燃、腐蚀性、神经毒性，要注意防护。

易挥发，使用后立即盖紧瓶盖，佩戴PE手套。

3、每加完一样晃匀，TEMED最后加。

（三）灌胶1、分离胶1ml枪吹打均匀，避免气泡，尽快灌入固定好的玻璃板中。

O，压平分离胶界面。

待胶凝后可见分割折线。

2、分离胶上灌满ddH2O，分隔线先清楚后不清楚，待胶凝后又可见。

可用乙醇代替ddH2O，用滤纸吸干。

3、分离胶凝后，倒去顶部ddH24、积层胶1ml枪吹打均匀，灌入玻璃板中至顶部。

5、插入梳子，注意梳子底部应无气泡。

略倾斜插入梳子可避免出现气泡6、20-30分钟后胶凝。

二、电泳（一）准备1、装上电泳装置，倒入1*电泳液。

先倒内槽（新）没过短玻璃板，如内槽不漏液再加外槽，没过钢丝电极即可，内外槽不能相通。

2、拔出梳子（用力均匀缓慢拔出），用10vl枪点样。

（二）上样和电泳1、10vl枪点样。

（1.0胶最大上样量30vl，0.75胶最大上样量25vl）2、样尽量点在中间孔位，空孔位用残样或5*buffer填补，避免边缘效应，使电流在胶板中均匀分布。

3、maker 3-3.5 vl。

Maker一般-20℃保存，尽快上样尽快放入冰箱。

4、盖上电泳槽，接通电源。

积层胶电压80V，分离胶160V。

电流28mA。

（恒压80V待Maker变红，转为160V，待成为一条直线）注意事项：1、枪头顶着泳道正上方加样。

2、电泳时温度上升，用冰袋围绕电泳仪使降温。

3、跑分离胶电压在130-160V之间，低于130V时时间较长，高于150V时较快但温度高电压大易烧坏胶。

4、细胞蛋白上样10vl左右，组织蛋白上样20vl左右。

5、当需要上样量较大或超过孔位最大上样量时，可先加一部分样跑电泳，然后再加剩下样本，使全部分样本在积层胶内汇集。

三、转膜（湿法）1、电泳结束后，撬开短玻璃板，切去积层胶，浸泡于转膜液。

2、用直尺或梳子量出凝胶大小，按尺寸剪滤纸和硝酸纤维素滤膜（PVDF膜）。

3、PVDF膜先浸入泡膜液（甲醇）中活化，然后放入转膜液中清洗。

4、海绵，滤纸，膜湿润，阴极电极（黑面）在下，从下到上顺序为：海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵。

膜与胶精准对齐，盖好滤纸后用玻璃棒赶出气泡。

5、转膜一般为80Ma,2小时。

当目标蛋白为72bp以上时转3h，72bp以下时转1.5-2h。

（210V，200MA，时间根据蛋白分子量来定）注意事项：1、撬胶时尽量把胶留在厚板上，记录上样顺序。

2、滤纸为3层，可重复利用，但最好使用1-2次后更换。

四、染胶考马斯亮蓝染料浸染，摇床5h。

使用脱色液脱去多余染料，可见胶中有蛋白的部位出现蓝色条带，证明胶中相应条带有目的蛋白。

在转膜前染胶可验证所提蛋白中是否有目的蛋白；在转膜后染胶验证转膜知否彻底。

五、染膜丽春红染料染膜，可见膜上有蛋白的部分出现红色条带，沿条带剪膜可避免漏剪或剪歪。

用dd水即可洗净染料。

六、封闭把膜放入装有封闭液的塑封袋中，一张膜1ml左右。

30°摇床1h。

O加入0.3g。

封闭液为3%BSA（牛血清蛋白），10mlddH2注意事项：1、首次做蛋白时可不做封闭，此时膜显色后背景较深。

看情况需要背景较浅时可做封闭。

2、封闭液4℃保存七、结合一抗1、蛋白一抗：稀释液为含有1%BSA的TBST（稀释的比例按说明说来进行条件摸索）2、将膜放入相应的塑封袋中，拍出气泡，4℃摇床过夜（12h）或常温2h摇床。

3、一张膜1.5ml左右，2张膜2-3ml，2张一起时膜的背面相贴。

注意事项：1、一抗放4℃保存半个月，可重复利用多次。

应一抗价格昂贵一般使用3-4次。

2、稀释抗体使用含有1%BSA的TBST溶液。

八、结合二抗1、取出一抗回收，膜使用1*TBST清洗，摇床，7min一次，洗三次。

（LST 15min*2+5min*4 荧光二抗 10mlBSA:1ul二抗 1小时）2、将滤膜放入有二抗的塑封袋中，去除气泡，37℃孵育30-40min。

最好是30℃孵育1h。

二抗稀释比 1:7500，配10ml。

或7.5mlTBS-T（含1%BSA）水中加入10µl二抗，3.5ml中加0.5µl二抗。

注意事项：二抗放4℃保存半个月，可重复利用，二抗无特异性较便宜一般使用3-4次。

九、染色1、取出二抗回收，膜使用1*TBS-T清洗，摇床，5min一次，洗三次。

LST 15min*2+5min*42.荧光显影液 A：B=12、将膜放入干净平皿中，注入1~2ml底物染色液，使用1ml枪将液体反复注于膜表面，5-10分钟后可见蛋白条带显蓝色。

3、用三蒸水清洗停止显色反应。

十、拍照留存试剂配方一、10*电泳液Tris-base 15.2g甘氨酸 94gSDS 5gDdH2O 500ml配好后需放置一段时间才可溶解。

1*电泳液 10*电泳液 100mlDdH2O 900ml注：不用再加SDS，如果10*电泳液中没加SDS则此时添加10%SDS10ml，890ml DdH2O.在配置的时候要定容，所以先加一些水，而且，电泳液好起泡泡，会有损失并且实体积胀大，所以配置的时候要轻柔加勺搅拌二、10*转膜液Tris-base 15.1g甘氨酸 72gDdH2O 500ml配好后需放置一段时间才可溶解。

1*转膜液10*转膜液 100ml甲醇 200mlDdH2O 700ml三、10*TBS Tris-base 12.114gNacl 43.9g浓Hcl 5mLDdH2O 500ml室温贮存。

1*TBST 500ml 1*TBS +500ul吐温第一抗体第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。

种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。

第二抗体第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。

二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。

用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体。

区别第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。

第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。

主要用于检测抗体的存在。

一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。

即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。

也就是说，抗原进入机体刺激机体免疫系统产生免疫应答，由B细胞可以产生与相应抗原发生特异性结合的特殊蛋白质。

一抗二抗都是一种可以特异结合别的物质的基团，而且一抗可以至少结合两种其他基团（底物和二抗）。

一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。

一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。

二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。

如果一抗自己带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。

但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物。

所以如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。

而一抗识别底物。

这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。

A MPK（Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase）即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。

它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。

遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。

由于分子机制十分复杂，药物分子激活AMP是一个巨大的挑战，但其激活能改善由II型糖尿病引起的代谢失衡。

AMP蛋白激酶（AMPK），它主要控制细胞新陈代谢：它会决定身体中的脂肪是储存还是燃烧，这主要取决于细胞中总能量。

当细胞能量水平较高时，细胞中存在高浓度的能量分子ATP（三磷酸腺苷），因此AMPK会促使细胞进行“合成代谢”，将多余能量作为脂肪储存下来；当ATP水平较低时，AMPK将关闭合成代谢，反而激发分解代谢，让脂肪燃烧为能量。

研究人员表示，AMPK能作为治疗2型糖尿病的一种有效手段。

当AMPK探测到细胞中ATP浓度较低时，它们会利用各种机制使细胞中的葡萄糖变为ATP。

对于啮齿类动物的实验已经表明，AMPK对于降低血糖是有效的。

PPAR分子含α、β、γ三型，分布在各不同组织，它的功能涵盖的范围之广是现今已知的其他生物医药分子所难望其项背，包括糖尿病、肥胖、高血压等代谢症候群，免疫发炎疾病如类风湿性关节炎，皮肤及伤口愈合，以及最近发现的多种癌症的治疗，PPAR分子都参与其中，并且扮演非常重要及突破性的角色。

而这些疾病正是二十一世纪人类面临的主要医药卫生问题。

引藻是有大量PPAR的，引藻的调脂降糖作用与其含有PPAR配体成分而激活人体内的PPAR有关。

PPAR有三种亚型，即PPARA、PPARA/A、PPARA，它们在脂肪细胞分化、脂质代谢、糖代谢、胰岛素敏感性等病理生理过程中起到重要作用。

目前已有多种PPAR配体被开发成药物，例如贝特类（PPARA配体）及噻唑烷二酮类（PPARA配体）分别能有效地治疗血脂异常及2型糖尿病。

引藻含有的PPAR配体可以激活人体内PPAR分子，有效清除因病毒感染导致胰岛受损所引起的胰岛抵抗。

达到平稳降糖，从根本上消除糖尿病病因。

并逐渐改酸性体质为碱性体质，因此对糖尿病患者相当有帮助。

此外，引藻中含有次麻油酸，对于稳定血脂质浓度的功效早已被确认。

另外，引藻还可以预防糖尿病病人最严重的动脉硬化所引起的心脏、肾脏、及脑溢血等并发症。

固醇调节元件结合蛋白1（Sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1）是重要的核转录因子之一,能调控内源性胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂合成所需酶的表达,以维持血脂动态平衡。

研究表明,SREBP-1及其靶基因网络的异常可引起胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病、心功能紊乱、血管并发症和肝脂肪变等一系列代谢性疾病。

近年高通量组学技术的发展极大扩展了对SREBP-1靶基因及其转录调控模式的了解。