2结 果
2. 1 超声和高压处理对蛋白聚集的影响 2. 1. 1 H PLC 结果 超声 使 BSA 产生严重的 聚集, 随 处理时间 的延 长, 聚集 体增 多, 处理 10m in 后的 样 品 U 10 聚集体含量达到 51% 13% 。高压破碎处理 4 次 (通常破碎细胞最多处理 2次 ) 的样品 P4, 图谱看不出 明显变化, 未发现蛋白聚集 ( 图 1)。 2. 1. 2 动态光散射结果 DLS数据显示超声 处理后, BSA 的流体动力学半径由 3. 6nm 增加到 4. 7nm, 均 一 性降低。高压处理后的 样品, 流体 动力学半 径及样 品 的均一性 ( pd% )几乎没有改变 (图 2 )。 2. 1. 3 非变性 SDS PAGE 电泳结果 BSA 超声处理后 的样品出现明显的 聚集体条带, 而高压处理 的样品 条 带没有变化 ( 图 3)。 2. 2 高压破碎和超声破碎对 BSA 二级结构的影响
2006, 26( 1)
罗昭 峰 等: 超声和高压处理对牛血清 450W, 破碎 1s, 间歇 1s)。分别在处理 0m in、1m in、2m in、3m in、4m in、5m in、6m in、8m in 和 10m in 后取样, 所对应的样品编号为 U0、U 1、 、U8、U 10。 1. 2. 3 样 品 的 高 压 处 理 样 品 体 积 15m ,l 压 力 20 000ps,i 流速 15~ 20滴 /m in。同一样品连续处理 4次, 处理前及每次处理后均取出 1m l作为待检样品 (分别记 为 P0, P1, P2, P3, P4; 其中 P0 为未处理的 BSA, P1 ~ P4 分别表示 BSA 经高压破碎处理 1~ 4次的样品 )。 1. 2. 4 H PLC 检 测 条 件 上 样 量 20 ,l 分 离 柱 为 W aters Prote in 300SW, 分离范 围 10 ~ 300kD a。检测 波 长 280nm, 柱 温 为 室 温, 流 动 相 PBS ( 同 上 ) 流 速 0 75m l /m in。 数 据 处 理 软 件 为 W aters 公 司 的 M illinum 32。 1. 2. 5 CD 谱测试条件 样品浓度为 160 g /m ,l 每 个 样品测量 3 次取平均。控制程序为 Spectra m anager; 测 量 时 以 PBS 作 为 空 白 对 照, 氮 气 流 量 控 制 在 4~ 5L /m in。二级结构的含量按杨氏公式计算。 1. 2. 6 动 态 光 散 射测 量 样 品 经 高 速 离 心 后, 用 0 1 m 微孔滤膜过滤后直接上样检测, 样品体积 12 。l 测试温 度 25 , 激 光 波 长 为 824nm, 其 它 参 数 采 用 Dynam ics V 6的默认设置。 1. 2. 7 非变性聚 丙烯酰胺凝 胶电泳 DTT 在变性 聚 丙烯酰胺凝胶电泳中的作用是打开二硫键。本实验中 未加入 DTT, 所以依赖于二硫键结合在一 起的 BSA 聚 集体, 电泳过程中始终保持聚集状态。
1 材料与方法
1. 1 试剂和仪器 牛血清白蛋白 ( S igm a aldrich 公司, A 7030) 。超声
破碎仪 VC750 ( Son ics公司 )。高压破碎 仪 ( FRENCH PRESSURE CELL PRE SS ) FA078( Therm o Spectron ic公 司 )。H PLC: W aters高 效液 相色谱 仪 ( 600 泵, 2487 紫 外检 测 器 )。 园 二 色谱 仪 J 810 CD 谱 仪 ( JASCO 公 司 )。 动 态 光 散 射 仪: Dyn ap ro M S800 ( PROTE IN SOLUT IONS 公司 )。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 蛋白溶液的配制 称取一定量的 BSA 溶解于 1
收稿日期: 2005 07 11 修回日期: 2005 10 20 * 电子信箱: lz@f us tc. edu. cn
目标蛋白结构的变化以及产生这种变化的机理。本文 直接以牛血 清白蛋白 ( B SA ) 作为研究 材料, 比较 高压 和超声处理下 BSA 结构的变化。为探讨这两种处理方 法在破碎细胞以及乳化蛋白时对蛋白的损伤机制提供 一定的实验基础。
10m in respect ively w ithou t m ann itol
3讨 论
3. 1 BSA 产生聚集的主要原因 聚集体的含 量随着超声 处理时间的 延长而增 多。
聚集可能由以下几个方面的原因造成: 一是热效应, 包 括整体温度的升高和空穴产生与复合伴随的局部高温 高压的变化。实验中利用冰浴使样品始终处于较低温 度。根据我们的 B SA 热稳定性实验结果以及已有的研 究报道 [ 12] , BSA 在 50 以 下不会 聚集, 所以 可以排 除
图 4 B SA超声和高压处理后 B SA二级结构的变化 F ig. 4 Th e secondary structure change of B SA after u ltrason ication and French press
2. 3 甘露醇对超声引起的 BSA 聚集的影响 在超声 处理的样品 中加入 100mm ol/L 的甘露 醇,
已有作者对两种方法的差别进行了探讨。在制备 -内酰胺酶[ 8]和氯霉素乙酰基转移酶 ( CAT) [9] 时高压破 碎效果较好。而在制备 半乳糖苷酶 [ 10] 和核酮糖 1, 5 二 磷酸羧化酶 /加氧酶 [11] 时, 超声却要优于高压破碎。
探讨两种方法作用机理上的差别对选择正确的破 碎方法具有重要的指导作用。已有的工作都是以细胞 作为样品, 以目标蛋白的活力作为检测指标, 可以直观 地反映出破碎方法的优劣。但是难以了解破碎过程中
induced by u ltrason ication 1~ 6: U ltrasound irrad iat ion 0, 2, 4, 6, 8, 10m in resp ectively w ith 100mm ol /L m ann ito;l 7~ 12: U ltrasound irrad iation 0, 2, 4, 6, 8,
破碎细胞是 制备胞内蛋 白的必需途 径, 目前用 于 细胞破碎的方法主要有超声破碎法和高压破碎法。但 迄今为止这两种破碎方法对目标蛋白的影响并没有一 个明确的结论。
超声破碎的机理涉及多种因素, 包括空穴产生与复 合伴随的高温 (几千 K)高压 (几百个大气压 )变化、机械 剪切力、气液界面的作用以及自由基的产生带来的理化 效应 [1] 。超声可以使一些大分子降解 [ 2, 3]、结构改变 [ 4] 、 形成聚集体以及化学键断裂等 [ 5]。高压破碎的机理主要 是由于样品流出时, 细胞内外压力降低的速度不同, 在膜 两侧形成巨大压力差, 使细胞膜破裂; 出口处液体高速流 动产生的剪切力也会导致细胞破裂 [ 8]。高压处理还可用 于乳化、制备脂质体以及降解高分子等 [ 6, 7]。
能对超声引起的聚集起到明显的抑制作用。超声处理 10m in 后, 含有甘露醇的样品中二聚体随时间延长而增 多, 单体略有减少; 而未加甘露醇的样品中, 10m in 后聚 集超过 60% , 单体显著减少 (图 5) 。
图 5 甘露醇对超声引起 BSA聚集的影 响 F ig. 5 M ann itol inh ib ition to th e BSA p olym er ization
PBS ( 137mm ol/L N aC ,l 2. 7mm ol /L KC ,l 4. 3mm ol/L N a2H PO4, 1. 4mm ol/L KH 2 PO4, pH 7. 2 ), 终浓度 1m g/ m 。l 用 0. 22微米的微孔滤膜过滤, 超声脱氧, 高速离心 ( 15 000 g, 10m in , 4 ), 取上清储于 4 备用 ( 24h 以内 使用 )。 1. 2. 2 样品的超声处理 将 35m l样品置于 50m l烧杯
Fig. 3 Nondenatu rin g SDS PAGE of BSA after u ltrasound irrad iation and French press
1, 3: BSA; 2: P4: Fren ch p ress 4 tim es; 4~ 6: U ltrasound irradiation for 0m in, 2m in and 4m in respectively at 450W
由于样品整体 温度升高导 致的聚集, 但 空穴破裂 时产 生的局部高温 高压仍有可 能引起聚集; 二是气液 界面 的存在, O liva等 [13] 发现在高速剪切时也会使 B SA 产生 聚集, 但这种聚集与剪切 速度没有 显著的 相关性。剪 切本身并不能 直接对蛋白 造成影响, 促 使聚集的 原因 在于蛋白自 身的性质和 剪切时产生大 量的气 液界面。 超声处理时无 法完全避免 气泡的产生, 所以认为 气液 界面是聚集产生的原因之一; 三是自由基的作用, 超声 处理产生的自由基会导致分子间形成二硫键, 从而引起 聚集。 BSA 含有大量的半胱氨酸, 加入自由基清除剂甘 露醇, 能显著抑制 BSA 聚集的产生 ( 图 5)。由此可以证 明自由基在 BSA的聚集中起着重要的作用。 3. 2 导致目标分子损伤的主要作用力
图 2 BSA 高压及超声处理前后 流体动力学半径的变化
Fig. 2 The hydrodynam ic rad ius d istr ibu tion of BSA by u ltrasound irradiation and Fren ch press
图 3 B SA经超声和高压处理后的 非变性 SDS PAGE 电泳
用 CD 测量 BSA 经两种方法处理前后二级结构的
图 1 BSA 经超声和高压处理后 HPLC 图谱的改变 Fig. 1 HPLC of BSA by ultrasound irrad iation and French press