本氏烟草N. benthamian瞬时表达及相关实验方法：
一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A、实验步骤：
1、根据实验需要,将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中,并转化农杆菌;
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中,28℃,200rpm过夜;
估算时间,防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率;
3、当菌液OD值介于~之间时,1000g,5min离心收集农杆菌;
4、用2ml Induction medium without AS轻柔重悬农杆菌,然后再次离心收集菌液;
5、重复步骤4;
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬;
7、室温放置1~4小时
8、测OD值,根据实验需要,配置侵染液组合详见下文;
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中;
使用注射器时注意安全,防止针头扎到手,使用完的注射器要把针头套套上再扔,或者将针头放到注射器里面,避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套,防止交叉污染;
B、试剂：
Induction medium：
MES-KOH PH 10mM
MgCl210mM
AS 200uM
推荐提前配制母液
1M MES-KOH 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
1M MgCl2 过滤灭菌,4℃保存,用时稀释100倍;
AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌,分装避免反复冻融,-20℃;
用高压灭菌的超纯水稀释;
C、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间,一般注射24小时之后到一周之内都会有表达;严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段,但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观,不要错过;
D、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在~之间;过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎;。