修剪外植体
接种
盖好瓶塞
外植体的灭菌处理
• 外植体灭菌流程 • 常用灭菌剂 • 灭菌关键性问题
– 适当的搭配 – 适当的浓度 – 适当的时间
外植体灭菌流程
材料的预处理 (剪切、清洗)
75%酒精 (20 s)
0.1%升汞 (15 min)
无菌水冲洗 （6次）
沥干
接种
外植体的预处理
对外植体进行修整,去掉不要的部分,在 流水下冲洗干净.
化的方法与技能。
一、外植体的种类与选择
1、外植体的种类
– 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。 包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质 体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器 官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对 象。
常见外植体类型
• 茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高， 不易发生遗传变异，但取材有限）
消毒注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒 剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以 除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其 切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质 的吸收。
第二节： 无菌外植体的选择与处理
本节主要内容
• 外植体的种类与选择 • 外植体的消毒 • 外植体的接种 • 外植体的初代培养与观察
–培养条件 –外植体的污染及其防治 –外植体的褐化及其防治 • 外植体的继代培养 –培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不
定芽的诱导与分化。 – 试管苗的增殖与生根诱导培养 – 试管苗的玻璃化与防治
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或 先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组 织培养。
5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水 冲洗至少5次。
灭菌关键性问题
• 适当的灭菌剂搭配 • 适当的灭菌剂浓度 • 适当的灭菌时间
注意接种操作
• 防止污染 • 分布均匀 • 注意根据培养对象选择接种方法
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
5-30 5-30 5-30 2-10 0.2-2 5-15 2-10 5-30 30-Байду номын сангаас0
很好 很好 很好 最好 好 好 很好 好 较好
常用的灭菌方法
(1)茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗---75%酒 精浸泡10-20min---无菌水洗2-3次或Naclo或升汞溶液泡 10-15min---无菌水洗3-4次
工作人员接种前应做的准备工作
• 个人卫生，穿工作服 • 洗手 • 用70% ~75%酒精擦手
酒精擦拭手
接种器皿、用具的灭菌
• 用具先用70%~75%酒精浸泡，后于酒精 灯外焰灼烧或用接种灭菌器灭菌。
酒精灯灼烧
器械消毒
酒精擦拭培养皿
外植体接种全过程
外植体消毒
浸泡5min
酒精擦拭
旋转灼烧
取外植体
– 选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织， 再生能力强，组培易成功。
– 选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选 取材料。
– 选择适宜的大小：根据不同的植物而异，太大容 易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活。 一般在0.5-1.0cm之间。
– 考虑发生途径：
外植体的选择与发生途径密切相关
作好接种前准备
（一）接种室的灭菌 （二）工作人员接种前应做的准备工作 （三）接种器皿、用具的灭菌 （四）超净工作台的灭菌 （五）材料的灭菌
接种室的灭菌
• 接种室的地面，墙壁要擦洗干净 • 接种前一夜用甲醛熏蒸10ml/m2 • 接种室还可以采用紫外灯灭菌
超净工作台的灭菌
• 开风机前将紫外灯打开30分钟以上 • 之后开风机15分钟 • 操作前用70%~75%酒精洗工作台面
• 茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） • 叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产
生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）； • 花球和花蕾 • 种子、根、块根、块茎、花瓣等。
常用的培养部位
茎尖
叶片
茎段
2、外植体的选择
• 选择原则
– 选择优良的种质：材料的选择要有目的,具有一定 的代表性,提高成功率,增加实用性。
外植体的表面灭菌
• 原则：
– 充分灭菌，但不伤外植体 – 不同的外植体，灭菌的要求也不一样
常用灭菌药剂的使用和效果：
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉
升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓/%
2 9-10 饱和溶液 0.1-1 70-75 10-12 1-2
1 4-50mg/L
清除难易 消毒时/min 灭菌效果
• 微型扦插法：带一叶的单芽茎段 • 丛生芽增殖法：茎尖或腋芽 • 器官发生法：根、茎、叶或花器官的各部分 • 胚状体发生法：胚性分生组织或生殖器官
二、外植体的消毒与接种
掌握一个原则：杜绝一切可能的污染 • 明确污染来源 • 作好接种准备 • 注意接种操作 • 监测接种效果
人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。
学习目标
• 掌握外植体选择、消毒及接种的方法与技能 • 熟悉外植体初代培养与观察的方法与过程 • 理解外植体污染与褐化的原因，掌握防治外植体
污染与褐化的方法与技能。 • 掌握培养物的分化诱导培养的方法与技能 • 掌握试管苗的增殖与生根诱导培养的方法与技能 • 理解试管苗玻璃化的原因，掌握防治试管苗玻璃
污染来源
物品因素
器 培养皿：洗→热压 皿 和 玻璃器皿：洗→干热（干热箱）或晾干 用 接种用具：用CCL4布擦→湿布擦→ 具
泡75%~95%酒精→烧
培养基：湿热
外部细菌：用水冲洗→化学药剂处理 培
养
材
茎尖培养 内部细菌
料
加抗生素：青霉素、利福平
操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸（甲醛或者甲醛： 高锰酸钾=10:1)
（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10-30min---70%酒 精漂洗---2%Naclo液浸10min---无菌水2-3次---取出种子 培养 （3）根及地下部器官的消互毒：自来水冲洗---纯酒精 漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---无菌水 洗3次 （4）花药的消毒：自来水冲洗 70%酒精浸泡数秒钟--无菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---无菌水洗2-3次